DNA片段的連接技術(shù)

發(fā)表于由

實(shí)驗(yàn)十三 DNA片段的連接技術(shù)
一、目的與原理
DNA酶切片段的聯(lián)接是兩DNA片段相鄰的5‘磷酸和3’羥基間可有連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個(gè)連接反應(yīng)在體外一般都有大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DNA連接酶和T4DNA連接酶催化，但是分子生物學(xué)試驗(yàn)中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬通過T4DNA連接酶對(duì)酶切片斷的連接操作，掌握這一DNA片段的連接技術(shù)。
二、材料和方法
1． 儀器
離心機(jī)，恒溫設(shè)備，真空干燥機(jī)，取液器
2． 試劑
T4DNA連接酶，10×T4DNA連接酶緩沖液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE緩沖液，電泳緩沖液、3M NaAc
三、操作步驟
取干凈、滅菌新Eppendorf管，按下表加入各試液
試液 體積（μl）
T4DNA連接酶緩沖液 1.5
λDNA 10
ATP 1
無(wú)菌水 1.5
連接酶 1
總體積 15
19–20℃ 保溫2小時(shí)，提取已連接好的DNA片段。電泳分析。
四、結(jié)果 （略）
五、注意事項(xiàng)
1、 該實(shí)驗(yàn)用的T4DNA連接酶最適反應(yīng)是37℃，但該溫度下DNA退火效率低，連接效率還不如22℃高。
2、 如果要檢驗(yàn)連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效，可重新連接酶切后的λDNA。若連接成功，則說(shuō)明有效。
實(shí)驗(yàn)十四 受體菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
一、目的與原理
當(dāng)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)時(shí)，即為感受態(tài)，而用理化手段使細(xì)菌處于感受態(tài)的操作為致敏過程。感受態(tài)細(xì)胞制備是重組基因能否實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)是通過鈣離子來(lái)誘導(dǎo)使之成為感受態(tài)細(xì)胞。
二、材料和方法
1． 材料：大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2． 儀器：
離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴，超凈工作臺(tái)，冰柜
3． 試劑
LB培養(yǎng)基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高鈷
TFB：10Mm MES（pH6.3）
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步驟
大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)在LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)到對(duì)數(shù)期。取1ml培養(yǎng)物7000rpm，離心3min，收集菌體。再重復(fù)一次。冰浴放置。用預(yù)冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。用預(yù)冷的氯化鈣懸浮菌體，冰浴15min, 7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。加入200μl預(yù)冷的氯化鈣（或TFB），放置于冰浴，即得感受態(tài)細(xì)胞，此細(xì)胞可現(xiàn)用，也可進(jìn)行下步操作。將懸液分裝于無(wú)菌離心管中，投入液氮，然后儲(chǔ)于-70℃保存。
四、結(jié)果 （略）
五、注意事項(xiàng)
一般地，新制備的感受態(tài)細(xì)胞48h后轉(zhuǎn)化效率降低，15d后失效。因此，感受態(tài)細(xì)胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用試管分裝可避免反復(fù)凍熔，損傷感受態(tài)細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)十五 重組片段的轉(zhuǎn)化及克隆和篩選
一、目的與原理
轉(zhuǎn)化是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。轉(zhuǎn)化技術(shù)在基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)領(lǐng)域中占有極重要的地位。目前用得較多的轉(zhuǎn)化技術(shù)為將人工構(gòu)建的重組質(zhì)粒到如受體細(xì)胞，使重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制和表達(dá)。
二、材料和方法
1.材料：大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2.儀器：
離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴，超凈工作臺(tái)，冰柜
3.試劑
LB培養(yǎng)基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;
TFB：10mM MES（pH 6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作步驟
1. 感受態(tài)細(xì)胞融化（在手心）
2. 加入溶于TE的待轉(zhuǎn)化外源DNA，冰浴30min。
3. 42℃熱沖擊2 min。
4. 冰上2min。
5. 加入0.4 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫?fù)u床45 min
6. 取0.2ml菌懸液涂布在含氨芐青霉素、IPTG、X-gal培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：
培養(yǎng)皿上有白色菌落和蘭 色菌落，但蘭色菌落數(shù)量很少。由于受體細(xì)胞本身的菌落為蘭色，所以白色菌落說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功；蘭色應(yīng)為轉(zhuǎn)化不成功。但是由于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒經(jīng)過了酶切和連接，若是在原酶切位點(diǎn)的連接進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，菌落為白色；若為酶切去一段DNA的的連接質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，菌落為蘭色（說(shuō)明在酶切上成功，連接上也成功，轉(zhuǎn)化上也成功）。
五、注意事項(xiàng)
關(guān)鍵要嚴(yán)格控制熱激時(shí)間，超過2min，則轉(zhuǎn)化會(huì)失敗。
免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)十六 單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)
一、原理
單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)又稱單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。指可溶性抗原在相應(yīng)抗體的瓊脂介質(zhì)中的擴(kuò)散，可定性、定量抗原。
二、操作步驟
1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺(tái)，將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。
2.取15ml瓊脂糖加到56℃預(yù)熱玻璃管中，加入約200微升抗血清，充分混勻后鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。
3.待凝膠凝固后打孔，直徑為3㎜，將孔內(nèi)瓊脂弄出。
4.將系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原和待檢抗原分別加到凝膠孔內(nèi)，每孔5微升。
將凝膠板置于濕盒內(nèi)，室溫過夜，觀察結(jié)果。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
發(fā)現(xiàn)沉淀環(huán)的大小與抗原的濃度成反比，基本成線性相關(guān)。其大小不僅與孔中抗原的濃度相關(guān)，而且和瓊脂中抗體的濃度有關(guān)。
實(shí)驗(yàn)十七 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)
一、原理
雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，是將抗原和相應(yīng)抗體分別加入同一凝膠板內(nèi)的相鄰小孔中。兩者相互擴(kuò)散,當(dāng)擴(kuò)散到他們的濃度比例合適的部位相遇時(shí),就會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀。
二、操作步驟
1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺(tái)，將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。
2.將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。
3.打孔，孔距為4㎜，
4.將抗血清按二倍稀釋法稀釋成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同濃度。
在周圍孔中加入不同濃度的抗體，中心孔加抗原。
將凝膠板置于濕盒內(nèi)，室溫過夜，觀察結(jié)果
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
濃度不同，形成不同的沉淀的線。
實(shí)驗(yàn)十八 免疫電泳
一、操作步驟
1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺(tái)，將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。
2.將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。凝固后，打孔。
3.在孔內(nèi)加入抗原，其中一孔內(nèi)加電泳指示劑。
4.將凝膠板放在電泳槽中進(jìn)行電泳，確定電泳時(shí)間。
5.電泳后在凝膠板上沿電泳方向平行挖2㎜寬的長(zhǎng)槽，加入抗血清。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將凝膠板放入濕盒，室溫放置12小時(shí)，可觀察在到沉淀弧線。
實(shí)驗(yàn)十九 對(duì)流免疫電泳
一、操作步驟
1．1％瓊脂糖融化后，置于56℃?zhèn)溆谩?br /> 2．取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，涼干。
3．將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。凝固后，打孔。
4．在孔內(nèi)分別加入抗原和抗體，每孔5微升，抗體點(diǎn)陽(yáng)極，抗原點(diǎn)陰極。
5．在電場(chǎng)中電泳50min，5V。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在小孔中間出現(xiàn)沉淀線。
實(shí)驗(yàn)二十 火箭免疫電泳
一、操作步驟
1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺(tái)。
3％瓊脂糖融化后，置于56℃?zhèn)溆谩?br /> 2.將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。凝固后，打孔。
3.將抗原按倍比稀釋，在孔內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和代測(cè)樣品，每孔5微升。
在10V電場(chǎng)中電泳3小時(shí)。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
發(fā)現(xiàn)在電泳方向上有拖尾，拖尾長(zhǎng)度與抗原濃度有關(guān)。