一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS),大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS－復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無(wú)關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率間呈負(fù)相關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測(cè)定，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。
二、儀器與試劑
1．材料：
硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。
2．試劑：
（1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis）
（2）10％的SDS溶液
（3）10％的過(guò)硫酸銨溶液
（4）四甲基乙二胺（TEMED）
（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris,PH8.8
（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris,PH6.8
（7）電極緩沖液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3
（8）樣品緩沖液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭
（9）染色液：0.15％考馬斯亮藍(lán)R250，溶于脫色液
（10）脫色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液
（11）標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。
3．儀器設(shè)備：
電泳儀，垂直電泳槽等。
三、操作步驟
1, 凝膠制備：
用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液，倒入，滴加入無(wú)離子水，待凝膠聚集后，倒出無(wú)離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。
2, 上樣：
分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1-1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3－5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過(guò)30ul不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗(yàn)樣品注入樣品槽。點(diǎn)樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2－3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠底1－2cm時(shí)，即可停止電泳。
3, 染色：
電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過(guò)夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。
四、結(jié)果 （略）
五、注意事項(xiàng)
1、 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當(dāng)，就不能得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。
2、 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。
3、 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對(duì)于這一類(lèi)蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。
4、 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測(cè)相對(duì)分子量。
5、 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。
實(shí)驗(yàn)八 Western bloting 技術(shù)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
Western bloting技術(shù)是用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的特定的靈敏的方法，由蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成。雜交技術(shù)主要有NC膜封閉，靶蛋白與第一抗體的反應(yīng)，結(jié)合靶蛋白的一抗和二抗的反應(yīng)，顯色等組成。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，用其他蛋白作為封閉液，將膜上余下的其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉，加入與檢測(cè)蛋白特異性的第一抗體，經(jīng)免疫反應(yīng)，一抗與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)洗膜液洗滌后，膜上僅在靶蛋白上結(jié)合抗體。在加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應(yīng)，反應(yīng)后，經(jīng)洗膜液洗滌，二抗僅存在于結(jié)合靶蛋白的一抗上。因?yàn)檫@種二抗都為酶標(biāo)抗體，通過(guò)酶標(biāo)反應(yīng)，在顯色液中，膜上結(jié)合靶蛋白—一抗—二抗的位置即將呈現(xiàn)一定的顏色。
二、材料與方法
1.材料
從微生物細(xì)胞中提取的多酚氧化酶（PPO）：10μl，20μl
NC膜：硝酸纖維素膜
2.儀器：
電轉(zhuǎn)移槽，電泳儀，塑料封口機(jī)，搖床
3.試劑：
轉(zhuǎn)移緩沖液：48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同時(shí)加入20%乙醇。
封閉液與稀釋液：PBS（牛血清白蛋白）
辣根過(guò)氧化物酶顯色液：現(xiàn)配現(xiàn)用
三、操作步驟
1.SDS-PAGE電泳見(jiàn)上個(gè)實(shí)驗(yàn)
2.電轉(zhuǎn)
⑴剪NC膜大小、濾紙與凝膠板一致，浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中5min。
⑵在轉(zhuǎn)移裝置中依次將三層濾紙、凝膠、濾紙、三層濾紙放在一起。
⑶將裝好的轉(zhuǎn)移裝置放入電轉(zhuǎn)移槽中NC膜一側(cè)向正極，凝膠一面向負(fù)極。
⑷接通電源電壓63V，電流90mA,轉(zhuǎn)移過(guò)夜。
⑸轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出裝置，依次取掉各層，用鉛筆在膜的上沿做標(biāo)記，切下其中一個(gè)孔所對(duì)應(yīng)膜的一半。
⑹NC膜的封閉：將NC膜放入一塑料袋中，加入封閉液3ml，封口，輕輕震蕩2h。
⑺將封閉好的NC膜放入另一塑料袋中，加入用封閉液稀釋的一抗，2.8ml，封口。4℃下輕搖2h。
⑻洗膜：棄去反應(yīng)液，用一抗稀釋液洗三次，每次10min。
將膜從PBS中取出轉(zhuǎn)至150mM氯化鈉，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震蕩10min。
⑼將二抗用二抗稀釋液稀釋?zhuān)瑢C膜放入塑料袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，輕輕震蕩1h。
⑽洗膜：取出膜轉(zhuǎn)至150mM氯化鈉，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震蕩10min，三次。
⑾將膜放入顯色液中，室溫輕輕搖動(dòng)，10min。
⑿待條帶出現(xiàn)后，立刻用水洗膜，然后轉(zhuǎn)入PBS中，觀察記錄。
實(shí)驗(yàn)九 等電聚焦電泳（IEF）分離蛋白及測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)
一、原理
等電點(diǎn)聚焦（IEF）是在電場(chǎng)中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展，等電聚焦是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點(diǎn)的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。
在電場(chǎng)中充有兩性載體和抗對(duì)流介質(zhì)，當(dāng)加上電場(chǎng)后，由于兩性載體移動(dòng)的結(jié)果，在兩極間逐步建立穩(wěn)定的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子或其他兩性分子存在于這樣的pH梯度中時(shí)，這種分子便會(huì)由于其表面電荷在此電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，并最終達(dá)到一個(gè)使其表面靜電荷為0的區(qū)帶，這時(shí)的pH則是該分子的pI，聚焦在等電點(diǎn)的分子也會(huì)不斷擴(kuò)散，一旦偏離其等電點(diǎn)后，由于pH環(huán)境的改變，分子又立即得到正電荷或負(fù)電荷，從而又向pI遷移。因此，這些分子總會(huì)是處于不斷擴(kuò)散和抗擴(kuò)散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.
二、儀器與試劑
1．材料：蛋白樣品
2．試劑：
聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)、尿素、NP-40、teiton-100
電極液：1M磷酸（陽(yáng)極液）、1M氫氧化鈉（陰極液）
固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶于500ml，定容為1000ml
染色液：0.35g考馬斯亮藍(lán)R－150溶于300ml脫色液中，加熱到60－70℃，加入0.3g硫酸銅。
脫色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水
樣品緩沖液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素
三、操作步驟：
1, 樣品制備：
用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應(yīng)透析后，冷凍干燥、再?gòu)?fù)溶于IEF樣品緩沖液。充分溶解后，離心去除不溶雜質(zhì)。
2,制模具：
洗干凈兩塊IEF專(zhuān)用玻璃板，進(jìn)行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅化面相對(duì)，放上夾條，夾子夾好。
3, 配膠：
膠液組成：6ml膠母液（10％，19/1）
6－8％尿素
1ml Ampholine (pH3.5-10)
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, 灌膠：配好的膠迅速灌入模具
5, 電泳：
等膠凝固后，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦干，小心放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，橫功率25W電泳，約10min后，暫停電泳，取下紙片，繼續(xù)電泳約30min，待電流達(dá)4mA以下，停止電泳。
6, 表面電極測(cè)定蛋白質(zhì)的pI
7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min
8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現(xiàn)
9, 可脫色至背景消除后干燥保存。
四、結(jié)果 （略）
五、注意事項(xiàng)
1、 兩性電解質(zhì)是等電聚焦的關(guān)鍵試劑，它的含量2﹪-3﹪較合適，能形成較好的pH梯度。
2、 丙烯酰胺最好是經(jīng)過(guò)重結(jié)晶的。
3、 過(guò)硫酸銨一定要新配置。
4、 所有水用重蒸水。
5、 樣品必須無(wú)離子，否則電泳時(shí)樣品帶可能走歪，拖帶或根本不成帶。
6、 平板等電聚焦電泳的膠很薄，當(dāng)電流穩(wěn)定在8mA，電壓上升到550V 以上，由于陰極飄移，造成局部電流過(guò)大，膠承受不了而被燒斷。
核酸技術(shù)
實(shí)驗(yàn)十 染色體DNA的提取
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。DNA的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)植物樣品在液氮下研磨以粉碎組織，通過(guò)裂解液裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑反復(fù)抽提，使DNA進(jìn)入水相與蛋白質(zhì)成分分開(kāi)，在RNase作用下，降解RNA以純化DNA。
二、材料以方法
1、 材料：培養(yǎng)菌體
2、 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，移液槍一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀
3、 試劑：
細(xì)胞裂解液 100 mM Tris-HCl
5 mM EDTA
500 mM NaCl
1.25% SDS
PH 7.5
飽和酚，氯仿/異戊醇，酚/氯仿/異戊醇
無(wú)水乙醇，70％乙醇，異丙醇
3 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE緩沖液，電泳載樣緩沖液
三、操作步驟
（1） 培養(yǎng)菌體
（2） 加入10 ml裂解液，1/10體積酚，于65℃下20－30 min，然后加入等體積的氯仿，輕搖
（3） 12000－15000rpm離心15 min
（4） 取上淸液，加入等體積氯仿，輕搖，12000－15000rpm離心15 min
（5） 取上淸液，加入0.6倍體積冷異丙醇（-20℃）或2倍體積冷無(wú)水乙醇（-20℃）
（6） 加入1/10體積的3 M NaAc(pH5.2)，置于室溫下10 min
（7） 12000－15000rpm離心10 min
（8） 倒棄液體留下沉淀，用70％乙醇洗滌沉淀
（9） 加入2倍體積無(wú)水乙醇
（10） 12000－15000rpm離心10 min
（11） 倒棄液體留下沉淀，真空干燥
（12） 復(fù)溶于2 ml TE
（13） 加入RNase，65℃或37℃處理10－30 min
（14） 加等體積酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm離心10 min
（15） 取上淸液，加入0.6倍體積冷異丙醇（-20℃）或2倍體積冷無(wú)水乙醇（-20℃）
（16） 加入1/10體積的3 M NaAc(PH5.2)，置于室溫下10 min
（17） 12000－15000rpm離心10 min
（18） 倒棄液體留下沉淀，用70％乙醇洗滌沉淀
（19） 真空干燥沉淀
（20） 復(fù)溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分裝成小體積，4℃或-20℃保存。
（21） 電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量
四、結(jié)果與分析
點(diǎn)樣空，若發(fā)亮則說(shuō)明有污染
超螺旋結(jié)構(gòu)DNA，若條帶有拖尾則
說(shuō)明有破碎的DNA
少量未清除的RNA
五、注意事項(xiàng)
1、 重點(diǎn)防止DNA的損傷，包括各種物理、化學(xué)和機(jī)械損傷。
2、 干燥好的染色體DNA最好溶于去離子水，以備后面直接利用。如果用TE 緩沖液溶解，后面還需去離子。
3、 取上清時(shí)，如果上清液過(guò)少，可再加入少量水，重新離心，取上清，避免DNA損失過(guò)多。
實(shí)驗(yàn)十一 質(zhì)粒DNA的提取與純化
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增，②細(xì)菌菌體的裂解，③質(zhì)粒DNA的純化。本實(shí)驗(yàn)采取的菌體裂解方法為堿解法，質(zhì)粒純化方法為梯度離心法。
二、材料與試劑
1、材料：大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2、儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀
3、試劑：
Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高壓滅菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高壓滅菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌，4℃保存。異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無(wú)水乙醇，70％乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑
三、操作步驟
1、細(xì)菌繁殖
LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，過(guò)夜
2、離心10 min，5000 rpm, 4℃；棄上淸液
3、沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5000 rpm, 4℃
加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min
8、離心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀
12、離心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14、電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量
三、結(jié)果與分析
超螺旋結(jié)構(gòu)DNA
四、注意事項(xiàng)
在本實(shí)驗(yàn)中，如果不經(jīng)過(guò)RNase處理，在電泳帶中，RNA會(huì)呈現(xiàn)極亮的帶，所以，建議使用RNase處理一下。離心時(shí)應(yīng)注意轉(zhuǎn)速不能太低，太低會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不純；也不要太高，否則質(zhì)粒不易溶解。電泳時(shí)應(yīng)注意電壓，電壓太高或混有蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)電泳帶容易產(chǎn)生偏離和拖尾。在DNA操作中應(yīng)盡可能輕地操作（尤其是分別加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ輕輕搖），否則質(zhì)粒容易斷裂，從而在觀察條帶時(shí)出現(xiàn)許多雜帶。無(wú)水乙醇可用于沉淀質(zhì)粒，如果質(zhì)粒量比較大的話，一般用異丙醇來(lái)沉淀。
實(shí)驗(yàn)十二 亞克隆技術(shù)
一、目的與原理
限制性?xún)?nèi)切酶是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，該類(lèi)酶是體外剪切基因片段的重要工具。實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ兩種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)λ DNA的單切酶、雙切酶及部分酶切的操作，掌握內(nèi)切酶的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。
二、材料與試劑
1．材料：λDNA
2．儀器：
離心機(jī)，恒溫水浴，取液器，電泳儀，電泳槽，紫外觀測(cè)儀
3．試劑
EcoRI及緩沖液，HindIII及緩沖液，λDNA,TAE緩沖液
三、操作步驟：
EcoRI、HindIII單酶切及部分酶切
取2只干凈、滅菌新Eppendorf管，分別按下表加入
試劑 A（μl）
滅菌水 0
10×緩沖液 2
質(zhì)粒 5
染色體DNA 12
EcoR I
1
HindIII
0
總體積 20
37℃保溫1—2小時(shí)。保溫結(jié)束后，分別加入0.5M（pH8.0）EDTA（使終濃度達(dá)到10mM）。加入6μl電泳加樣緩沖液。
電泳。
EcoRI、HindIII雙酶切
取1只干凈、滅菌新Eppendorf管，按下表
加入試劑 體積（μl）
滅菌水 14
10×緩沖液 2
λDNA 2
EcoR I
1
HindIII
1
總體積 20
37℃保溫1—2小時(shí)。保溫結(jié)束后，分別加入0.5M（ pH7.2）EDTA（使終濃度達(dá)到10mM）。加入6μl電泳加樣緩沖液。電泳分析。
四、結(jié)果 （略）
五、注意事項(xiàng)
1、 酶的量不超過(guò)總體積的1﹪，以為酶的保存液中含有甘油，甘油太多會(huì)形成星活性，切下非目的片段。
2、 在加入模板DNA以前可加入少量BSA，減輕管壁對(duì)酶的吸附作用。
3、 如果用雙酶切，必須注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可以用同種緩沖液，則可同時(shí)水解，否則低鹽濃度的限制酶必須先用，隨著調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿（1：1）抽提，加0.1倍體積的3mol/LnaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后-20℃放置30分鐘，離心，干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。