實(shí)驗(yàn)一 多酚氧化酶（PPO）的分離提取 DEAE－纖維素DE 52

一、原理與目的
多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機(jī)械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)微生物有毒害作用，所以傷口醌類(lèi)物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會(huì)提高。多酚氧化酶也可與細(xì)胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營(yíng)養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類(lèi)物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標(biāo)之一。
本實(shí)驗(yàn)將采用馬鈴薯為主要材料，通過(guò)組織細(xì)胞破碎勻漿、過(guò)濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。
通過(guò)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術(shù)。
二、材料與試劑
（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）
（2）試劑：
0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時(shí)配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時(shí)配
（3）實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：
試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；
過(guò)濾紗布；植物組織勻漿器；pH計(jì)和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機(jī)；
DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī)
三、操作步驟
1：粗酶提?。?br /> 水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過(guò)濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。
2：鹽析分級(jí)沉淀：
在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達(dá)到40%飽和度（邊加邊攪拌達(dá)到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達(dá)到70%飽和度（邊加邊攪拌達(dá)到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
獲得PPO粗酶液。
實(shí)驗(yàn)二 PPO粗酶液的純化
一、原理
1.葡聚糖凝膠Sephadex G-200凝膠柱層析 利用大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 最先流出柱外，而小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開(kāi)。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)）
2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因?yàn)镻PO是帶有陽(yáng)離子的蛋白質(zhì)，在層析時(shí)會(huì)吸附在柱材料上，而雜蛋白會(huì)洗下。后用NaCl梯度洗脫P(yáng)PO，（NaCl為強(qiáng)離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來(lái)）。粗酶液從而得到純化。
二、材料與試劑
試劑：0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)配制時(shí)配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠Sephadex G-200;蘭葡萄糖－40、70、100等；
實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計(jì)和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀、GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī)
三、操作步驟
1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡
（1）柱材處理
稱(chēng)取一定量的Sephadex G-200干粉，加無(wú)離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細(xì)微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進(jìn)抽濾瓶中，進(jìn)行抽真空處理，直到凝膠液中沒(méi)有氣泡出現(xiàn)為止。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開(kāi)下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過(guò)低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開(kāi)層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝膠。
2．上樣：將粗酶液上柱。
3．洗脫：用0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測(cè)定。
4．DEAE－纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實(shí)驗(yàn)采用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無(wú)離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無(wú)離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開(kāi)下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開(kāi)層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M EDTA)，預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。
5．上樣：
將洗脫酶液上樣，用0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。
6．洗脫：
用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL緩沖液pH7.4(內(nèi)含0.001M EDTA)進(jìn)行梯度洗脫。
7．測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)濃度
實(shí)驗(yàn)三 PPO活性測(cè)定
一、原理與方法
PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實(shí)驗(yàn)是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計(jì)410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過(guò)OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。
其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計(jì)410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01O.D.值定義為一個(gè)酶活性單位（U）。
二、儀器與試劑
（1）樣品：
多酚氧化酶粗酶液
硫酸銨沉淀組分
DE-52洗脫組分
葡聚糖凝膠洗脫組分
（2）底物：
鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液
（3）反應(yīng)體系：
0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8
（4）器皿與儀器：
試管、恒溫水浴等
分光光度計(jì)
三、酶蛋白的比活性
比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質(zhì)
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）
結(jié)果列表
試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.16 0.09
粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03
1 0.00 0.01 5 0.03 0.01
2 0.13 0.09 6 0.02 0.02
分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進(jìn)行下一步純化。
2. DE-52的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）
結(jié)果列表
試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.03 0.05
粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05
1 0.00 0.00 5 0.07 0.02
2 0.03 0.02 6 0.03 0.00
分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白。
實(shí)驗(yàn)四 胰酶分離提取
一、原理與目的
提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級(jí)沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，最后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。
胰酶在PH3.0時(shí)最穩(wěn)定，可在低溫下儲(chǔ)存較長(zhǎng)的時(shí)間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時(shí)，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過(guò)程應(yīng)在低溫和低PH下進(jìn)行。胰酶以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理?xiàng)l件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環(huán)化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過(guò)程中，酶原N端Lys與Ile之間的 一個(gè)肽鏈被斷裂，丟失一個(gè)6肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變，PI變成10.8。
本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時(shí)為親和層析、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣品。
二、材料與試劑
1．儀器
紫外光分光光度計(jì)、恒溫水浴、離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、PH計(jì)、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。
2．材料：新鮮豬胰臟
3．試劑及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時(shí)稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。
0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用PH計(jì)校正。
三、操作步驟
1．胰蛋白酶原的提取與分離：
（1）稱(chēng)取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機(jī)絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機(jī)搗碎）加1－2倍體積以預(yù)冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提?。ò?g組織相當(dāng)于1ml體積計(jì)算，以此類(lèi)推）。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時(shí)應(yīng)及時(shí)用10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過(guò)濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘?jiān)淮危〞r(shí)間約為1－2h），合并濾液，此時(shí)濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調(diào)整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進(jìn)行自然過(guò)濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。
(2)鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進(jìn)行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過(guò)夜，次日用4000r/min離心機(jī)離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱(chēng)重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。
（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測(cè)定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因?yàn)榱蛩徜@可以與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過(guò)少會(huì)直接影響胰酶原的激活過(guò)程，按濃度量計(jì)算，將已研細(xì)的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調(diào)PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。
（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經(jīng)研細(xì)的硫酸銨粉末，使其溶液達(dá)40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。
實(shí)驗(yàn)五 卵清蛋白分離提取
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對(duì)胰蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對(duì)熱和高濃度的脲都是相當(dāng)穩(wěn)定的，而在堿性溶液中較不穩(wěn)定。
由于雞卵粘蛋白對(duì)胰蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基配制純化胰酶的親和材料。
二、材料與試劑：
1．材料：新鮮雞蛋2只
2：儀器：抽濾瓶500－1000ml、燒結(jié)漏斗、移液器、磁力攪拌器
3：試劑：
10％TCA，用固體NaOH調(diào)調(diào)PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml
pH8.0,0.1M Tris-HCL緩沖液
三、操作步驟
1，取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置于燒杯中，外用溫水浴25℃－30℃，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最終PH約3.5，再繼續(xù)攪拌30min，然后在4℃冰箱中放置過(guò)夜。
2,次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。
3，邊攪拌邊加入4℃預(yù)冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm離心5min，收集沉淀。
4，將沉淀溶于10ml無(wú)離子水中，對(duì)無(wú)離子水（50倍）透析4h，換水兩次，再對(duì)碳酸鈉緩沖液透析過(guò)夜，4000rpm離心10min ,去除不溶物。
實(shí)驗(yàn)六 親和層析純化胰酶
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
生物大分子化合物的重要特征之一是具有與某些相對(duì)應(yīng)的分子通過(guò)次級(jí)鍵或共價(jià)鍵專(zhuān)一結(jié)合的能力即親和力。例如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結(jié)合的雙方不僅是專(zhuān)一的，而且結(jié)合以后可以在不喪失生物活性的基礎(chǔ)上用物理或化學(xué)的方法進(jìn)行解離。根據(jù)這一特性，如果把具有親和力的一對(duì)分子的某一方連接于水不溶的固體載體上作為固定相，那么另一方隨著流動(dòng)相流經(jīng)該固定相的時(shí)候，雙方便親和結(jié)合為一個(gè)整體。然后只有改變某種物理?xiàng)l件或化學(xué)條件使結(jié)合的雙方解離，即能得到于固定相有特異親和力的某一特定物質(zhì)。這種利用生物分子和相對(duì)應(yīng)分子之間親和結(jié)合和解離性質(zhì)而建立起來(lái)的層析方法稱(chēng)之為親和層析。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將胰蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)－雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過(guò)程和技術(shù)。
二、儀器與試劑
1.雞卵粘蛋白制備
2．Sephadex-G75的活化和偶聯(lián)
2．5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水）
3．親和層析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml
儀器器材：抽濾瓶500－1000ml、層析柱、紫外分光光度計(jì)、紫外蛋白檢測(cè)儀、燒杯漏斗、移液管、磁力攪拌器
三、操作步驟
1、雞卵粘蛋白的制備
2、Sephadex-G75的活化及偶聯(lián)
2.5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數(shù)次，緩慢攪拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75％K2CO3，調(diào)pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應(yīng)過(guò)程隨時(shí)加入5％K2CO3,以維持pH的穩(wěn)定。0.27gKBH4 溶于20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應(yīng)5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。
3、胰蛋白酶的親和層析
卵類(lèi)粘蛋白在pH7－8的條件下能與胰蛋白酶專(zhuān)一地結(jié)合，而在pH2－3時(shí)又能解離，因而掌握好上柱地PH條件和洗脫緩沖條件，便可將胰蛋白酶從含雜蛋白地粗酶液中選擇性地結(jié)合于柱上，待洗去不結(jié)合或非專(zhuān)一性結(jié)合地雜蛋白后，改變PH值便可將胰蛋白酶洗脫下來(lái)。從而達(dá)到純化地目的。由于親和層析結(jié)合地專(zhuān)一性，上柱體積可以比較大，得到濃縮的提純產(chǎn)品。
(1)親和層析
將雞卵粘蛋白－Sephadex-G75裝柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩沖液平衡，平衡約2－3倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監(jiān)測(cè)儀280nm處檢測(cè)蛋白質(zhì)吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達(dá)到穩(wěn)定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過(guò)柱的負(fù)荷時(shí)，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時(shí)應(yīng)停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩沖液沖洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線(xiàn)后，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來(lái)的蛋白峰蛋白，測(cè)總蛋白量及比活性，并根據(jù)上柱樣品的總蛋白量和比活性計(jì)算經(jīng)親和層析后胰蛋白酶比活性提高的倍數(shù)，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。
當(dāng)胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線(xiàn)后，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復(fù)使用。
（2）胰酶蛋白和活性測(cè)定