–Cellstain®- DAPI solution

03 分子生物學(xué)関連試薬

05 細(xì)胞染色用色素

–Cellstain®- DAPI solution

• 分子生物學(xué)関連試薬
• 細(xì)胞染色用色素

死細(xì)胞染色色素

• 製品コード
  D523　 –Cellstain®- DAPI solution
• CAS番號
  28718-90-3(DAPI)
• 化學(xué)名
  4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, solution
• 分子式?分子量
  C₁₆H₁₇Cl₂N₅=350.25

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マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

 ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強(qiáng)度が強(qiáng)くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の點(diǎn)がございます。
【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結(jié)合します。
生細(xì)胞の膜透過性がなく、死細(xì)胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時(shí)の蛍光強(qiáng)度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細(xì)胞の膜透過性がなく、死細(xì)胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結(jié)合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結(jié)合性を持っています。
生細(xì)胞の膜透過性がなく、死細(xì)胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結(jié)合した時(shí)では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を區(qū)別して検出できます。
生細(xì)胞の細(xì)胞膜を透過します。

【Hoechst33342?33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結(jié)合します。
生細(xì)胞の細(xì)胞膜を透過し、生細(xì)胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細(xì)胞染色色素の勵(lì)起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

 

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm勵(lì)起で観察されることもあります

Q

DAPIを核染色に用いたいのですが、どのように使用すればよいのでしょうか？

A

下記のような使用報(bào)告例がございます。
【DAPI を用いた細(xì)胞染色の例】
固形腫瘍あるいはcluster を含むsample のDAPI 染色の例（參考文獻(xiàn)3）

1) 0.02 ％トリプシン – EDTA 処理し、37 ℃で30 分間 incubate 後、
　　1,500 rpm で５分間遠(yuǎn)心分離を行ない、上清をすてる。

2) -20 ℃の50 % methanol （ethanol でも可）にて固定後、
　　1,500 rpm で５分間遠(yuǎn)心分離を行ない、上清をすてる。

3) -20 ℃の30 % methanol にて洗浄後、1,500 rpm で
　?。捣珠g遠(yuǎn)心分離を行ない、上清をすてる。

4) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で
　?。捣珠g遠(yuǎn)心分離を行ない、上清をすてる。

5) RNase の0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）溶液 (1 mg/mL ) を
　　細(xì)胞10^6 個(gè)あたり0.2 mL を加え、37 ℃にて30 分間 incubate する。

6) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で５分間遠(yuǎn)心分離を行ない、上清をすてる。

7) 1 μg/mL のDAPI 溶液10 mL 加え、4 ℃にて２時(shí)間遮光の上染色する。

【DAPI を用いた細(xì)胞染色の例】

Vollenweider らはリンフォカイン活性化キラ－（LAK）細(xì)胞の細(xì)胞増殖アッセイにおいて、
　DAPI 染色を行ない、蛍光プレ－トリ－ダ－を用いて測定している(參考文獻(xiàn) 2)。
その時(shí)の濃度はストック溶液で0.1 mg/mL の水溶液、使用濃度は1 μg/mL のメタノ－ル溶液を用い、
1 well 當(dāng)たり 100μL 使用して蛍光染色している。

 

 

【參考文獻(xiàn)】
1) W. Schnedl, A.-V. Mikelsaar, M. Breitenbach, O. Dann, Hum. Genet., 36, 167 – 172 (1977).
2) I. Vollenweider, P. Groscurth, J. Immunol. Methods, 149, 133 (1992).
3) M. A. Hotz, J. Gong, F. Traganos, Z. Darzynkiwicz, Cytometry, 15, 234 – 244 (1994).
4) N. Poulin, A. Harrison, B. Palcic, Cytometry, 16, 227 – 235 (1994).
5) C. Souchier, M. French, M. Benchaib, R. Catallo, P. A. Bryon, Cytometry, 20, 203 – 209 (1995).