–Cellstain^®– Calcein-AM

05 細(xì)胞染色用色素

–Cellstain^®– Calcein-AM

• 細(xì)胞染色用色素

生細(xì)胞染色用色素

• 製品コード
  C326　 –Cellstain^®– Calcein-AM
• CAS番號
  148504-34-1
• 化學(xué)名
  3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester
• 分子式?分子量
  C₄₆H₄₆N₂O₂₃=994.86

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マニュアル

Q

51Cr-release法との相関はありますか？

A

Calcein-AMと51Cr-release法に相関性はあります。

下記文獻(xiàn)にその報告があります。
N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)

Q

細(xì)胞染色色素の勵起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488nm勵起で観察されることもあります

Q

細(xì)胞染色試薬Cellstainの生細(xì)胞染色色素の中で細(xì)胞內(nèi)に長く留まるのはどれですか？

A

細(xì)胞內(nèi)の保持という意味ではやはり「CFSE」が一番細(xì)胞の中に長くとどまることが出來ます。
蛍光強(qiáng)度は落ちますが、8週間細(xì)胞の中に蛍光色素があったのが確認(rèn)されております。
「Calcein-AM」「BCECF-AM」で3日間蛍光が観察されております。
「Calcein-AM」は6時間で90％細(xì)胞內(nèi)に保持されているとの報告もございます。
?S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)
?H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)

ただ、細(xì)胞障害活性ということでは「Calcein-AM」「BCECF-AM」の方が影響を及ぼさない
といわれております。
?L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)

あと注意點(diǎn)としては、元々の基本骨格がF(xiàn)luoresceinなので、勵起光による退光が
起りやすいので長時間の勵起による蛍光観察は難しいかもしれません。
（退光防止剤などを使用すれば幾分よいかもしれませんが）

Q

Calcein-AMの使用方法を教えてください。

A

下記に一例としてHeLa細(xì)胞の場合を紹介します。
細(xì)胞の種類、観察條件に応じて試薬濃度の検討や固定を行って下さい。

【試薬】
A液：Calcein-AM 1mg をDMSO 1mlに溶解する→1 mmol/L溶液
　?。芤氦伪４妞狭踊蛞证à毪郡帷⒄诠庀?20 ℃で行ってください。
B液：A液をPBS(-)で500倍に希釈する(A液10μlをPBS 5 mLで希釈すると2 μmol/Lとなる）
　　＊Calcein-AMは水溶液中で分解するので、B液は用時調(diào)製を行ってください。

【操作】
1)HeLa細(xì)胞をトリプシン-EDTAなどで回収し、細(xì)胞の懸濁液を準(zhǔn)備する。
2)細(xì)胞懸濁液を遠(yuǎn)心分離する(1,000 rpm,3 min)
3)上清を除き、PBS(-)を添加する(このとき細(xì)胞數(shù)が105～106 cells/mLになるように調(diào)製する）
4)ピペッティングなどで十分分散させる。
?。囵B(yǎng)液中の血清などはバックグランドを上昇させる恐れがあるので、2)～4)の操作を
　　繰り返し行い、十分に洗浄する。
5)1.5mlマイクロチューブに4)で得た細(xì)胞懸濁液30μlを添加する。
6)これに[B液]を15 μL添加する。
7)マイクロチューブに蓋をして、37 ℃で15分間インキュベートする。
8)カバーガラス上に7)の液10 μLをのせ、上からカバーガラスを重ね、染色した細(xì)胞懸濁液を挾み込む
9)このカバーガラスを蛍光顕微鏡に置き、490 nmのフィルターで勵起させ、黃緑色の蛍光を発する生細(xì)胞を観察する。
?。ē榨％毳咯`については490±10 nmのものであれば良好に観察することができる）

*血清やフェノールレッドはバックグラウンドとなるので除いておくこと。
*バックグランドが高い場合には、洗浄を行ってください。
*スライドガラス上に培養(yǎng)した細(xì)胞も同様に染色?観察が可能です。
*PIとの二重染色方法は、プロトコル「生細(xì)胞?死細(xì)胞を染め分けたい」をご覧下さい。

Q

Calcein-AM(粉末）を購入し、溶液にしたいのですがどうすればよいですか？

A

DMSOに溶解してください。
分子量がほぼ1000ですので、1 mgを1 mLのDMSOに溶解していただくと1 mMの溶液になります。
DMSOはなるべく乾燥したものをご使用下さい。