Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

08 ラベル化剤

Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

• ラベル化剤
• 細(xì)胞機(jī)能解析
• 50-200?
• SH

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット

• アミノ基でうまくいかなかった
• ELISAを組みたい

• 製品コード
  LK13　 Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

• ご購(gòu)入方法
• お問(wèn)い合わせ

マニュアル

Q

Labeling Kitで1次抗體を直接標(biāo)識(shí)する利點(diǎn)を教えてください。

A

はじめて抗體標(biāo)識(shí)をされる方を?qū)澫螭趣筏骏抓恁去偿毪蜃鞒嗓筏皮辘蓼埂?br /> カスタマーサポートの視點(diǎn)から直接標(biāo)識(shí)法の利點(diǎn)や実施例等を記載しておりますので、ご參照下さい。
下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗體標(biāo)識(shí)プロトコル　～カスタマーサポートの視點(diǎn)から～」

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

A

共存物の種類(lèi)により影響することがあります。
溶液中にどのような物質(zhì)が含まれるかを確認(rèn)の上、狀況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標(biāo)識(shí)反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1萬(wàn)以上＞
影響する可能性があります。
高分子でSH基をもつ化合物は、Filtration Tubeでも除くことができません。 そのため標(biāo)識(shí)され、蛍光性不純物として影響します。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。 一方、SH基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標(biāo)識(shí)?精製操作に支障がでる可能性もあります。
＊本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗體の精製について、小社抗體精製キット（下記）を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A　　　IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code：AP01もしくはAP02)

市販の抗體 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書(shū)に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ（Collagenase）によるゼラチン分解

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: ゼラチン含有IgG溶液 2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬 ?コラーゲナーゼ（Sigma, #C7826） 3.5 CDU/ml 希釈溶液 ?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ?市販の抗體 200 μg (2)精製方法 ?0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調(diào)製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。 ?37℃、3時(shí)間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※IgG Purification Kitでは、抗體を固定化擔(dān)體に保持させる際の抗體溶液量を一回當(dāng)たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗體溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを擔(dān)體に保持させる操作を8回（200 μl×7, 100 μl×1）に分けて行う。 ※上記の方法で得られる抗體の回収率：45～50%

B. 300K 限外ろ過(guò)チューブを用いたゼラチン除去

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: IgG 2: ゼラチン含有IgG溶液 3: 300K限外濾過(guò)のみのIgG溶液 4: 300K限外濾過(guò)+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬 ?300K フィルトレーションチューブ（Pall社 ナノセップ遠(yuǎn)心ろ過(guò)デバイス（製品コード：OD300C33） ?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ?市販の抗體 200 μg (2)精製方法 ?0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過(guò)を行う（200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g）。 ?その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸著操作は5回繰り返す。 ※上記の方法で得られる抗體の回収率：35～45%

 

Q

SH-Reactive ALPはbufferに溶解後、保存できますか？

A

溶解後は保存せず、すぐに使用して下さい。
SH-Reactive ALPは水溶液にすると反応部位が徐々に分解するため、反応効率が低下します。

Q

サンプルが水溶液になっていますが、ラベル化に問(wèn)題はないでしょうか？

A

問(wèn)題はありません。

但し、添付のFilitration tubeの容量に制限がありますので、サンプル溶液の容量は100 μl以下である必要があります。
また、サンプルの濃度が0.5 mg/ml以下（50 μg/100 μl以下）である場(chǎng)合は、Filitration tubeを用いてサンプル量が50～200 μgとなるようにして下さい。
溶液をFilitration tubeにいれて遠(yuǎn)心して溶液を除く操作を行って下さい。(必要であれば繰り返す)
フィルター上に殘っているサンプルの量が50～200 μgとなればよいので、改めて溶解させる必要はありません。

＊注：低分子の阻害物質(zhì)は最初の段階で除かれますが、高分子(分子量1萬(wàn)以上)の阻害物質(zhì)(例；BSA、ゼラチン)は除くことが出來(lái)ません。使用前に別途除去して下さい。

Q

低分子のタンパク質(zhì)（分子量50,000 以下）に標(biāo)識(shí)する場(chǎng)合の方法を教えて下さい。

A

キット付屬のフィルトレーションチューブは分畫(huà)分子量30Kの限外濾過(guò)フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質(zhì)のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質(zhì)を標(biāo)識(shí)される場(chǎng)合は、下記のような分畫(huà)分子量の小さい限外濾過(guò)フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質(zhì)でもラベル化可能でございます。

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PALL社　ナノセップ　 3K　製品No.OD003C33
PALL社　ナノセップ　10K　製品No.OD010C33 
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キット同梱のフィルターを用いた場(chǎng)合に比べ遠(yuǎn)心に時(shí)間を要することがございますので遠(yuǎn)心時(shí)間はご検討下さい。

Q

どのようなものが標(biāo)識(shí)できますか？

A

分子量が「50,000 以上」で[S-S]もしくは[SH]を有しているもの、分子量が「5,000 以下」で[SH]を有している化合物(抗體、蛋白質(zhì)など)であれば標(biāo)識(shí)できます。

分子量が「5,000以下」、「50,000 以上」で操作方法が若干異なりますので、製品に添付の説明書(shū)をご覧いただき標(biāo)識(shí)反応を行ってください。

Q

IgG １分子に対して、どれくらいのAlkaline Phosphataseが標(biāo)識(shí)されますか？

A

還元IgG １分子に対して平均1～2分子のAlkaline Phosphataseが標(biāo)識(shí)されます。

Q

標(biāo)識(shí)率は出せますか？

A

標(biāo)識(shí)後のサンプル溶液には、未反応のReactive體が含まれるため標(biāo)識(shí)率を算出することはできません。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。