日本同仁化學(xué)抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit – NH2 

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抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit – NH2

08 ラベル化剤

HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit – NH2

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

  • ラベル化剤
  • 細(xì)胞機(jī)能解析
  • 蛍光色素
  • 顕微鏡
  • FCM
  • 50-200?
  • NH2

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット

  • 簡(jiǎn)単な操作で実験したい
  • 抗原認(rèn)識(shí)部位を妨害しない低分子で標(biāo)識(shí)したい
  • Cy3と類似した蛍光特性を持つ色素でみたい
  • 製品コード
    LK14  HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit – NH2
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
3 samples ¥23,800 348-91041
サンプル量 50-200 µg
所要時(shí)間 2時(shí)間
標(biāo)識(shí)部位 -NH2
検出方法 顕微鏡?FCM
蛍光特性 [Ex:555, Em:570]

?分子量50,000以上のタンパク質(zhì)が標(biāo)識(shí)できる。

?Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標(biāo)識(shí)體が得られる。

?付屬の保存溶液でHiLyte Fluor™標(biāo)識(shí)體の保存ができる。

キット內(nèi)容
3 samples ?NH2-Reactive Hilyte FluorTM 555
?WS Buffer
?Reaction Buffer
?Filtration Tube
3 tubes
4 ml x1
500 μl x1
3 tubes

  • 抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 
試験成績(jī)書

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マニュアル

  • 取扱説明書 抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2  日本語(yǔ)
    抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 
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技術(shù)情報(bào)

特長(zhǎng)

1) 約2時(shí)間でHiLyte FluorTM標(biāo)識(shí)體が調(diào)製できる。
2) 分子量50,000以上のタンパク質(zhì)が標(biāo)識(shí)できる。
3) 50~200 μgのタンパク質(zhì)を標(biāo)識(shí)可能である。
4) Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標(biāo)識(shí)體が得られる。
5) 付屬の保存溶液でHiLyte FluorTM標(biāo)識(shí)體の保存ができる。
*HiLyte FluorTMはAnaSpec 社の商標(biāo)です。同仁化學(xué)では試験?研究用として許諾を得ております。

參考文獻(xiàn)

參考文獻(xiàn)を表示する

1) A. Nagao, K. Sato, K.M. Nishida, H. Siomi, M.C. Siomi, "Gender-specific hierarchy in nuage localization of PIWI-interacting RNA factors in Drosophila", Front Genet.,2011, 2, 55.
2) H. Hoshino, G. Shioi, S. Aizawa, "AVE protein expression and visceral endoderm cell behavior during anterior–posterior axis formation in mouse embryos: Asymmetry in OTX2 and DKK1 expression", Dev. Biol.., 2015, 402, (2), 175.
3) T. Kaneko, T. Minohara, S. Shima, K. Yoshida, A. Fukuda, N. Iwamori, T. Inai and H. Iida, "A membrane protein, TMCO5A, has a close relationship with manchette microtubules in rat spermatids during spermiogenesis", Mol. Reprod. Dev.., 2019, 86, (3), 330.
4) Y. Nakashima, T. Mima, M. Yashiro, T. Sonou, M. Ohya, A. Masumoto, S. Yamanaka, D. Koreeda, K. Tatsuta, Y. Hanba, M. Moribata, S. Negi, T. Shigematsu, "Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) 23 and Klotho in the spleen: its physiological and functional implications", Growth Factors ., 2016, 34, (5-6), 196.
5) Z. Zhang, K. Kakutani, K. Maeno, T. Takada, T. Yurube, M. Doita, M. Kurosaka and K. Nishida, "Expression of silent mating type information regulator 2 homolog 1 and its role in human intervertebral disc cell homeostasis", Arthritis Res. Ther.., 2011, 13, (6), R200.
6) I. Hasan, M. Gerdol, Y. Fujii and Y. Ozeki, "Functional Characterization of OXYL, A SghC1qDC LacNAc-specific Lectin from The Crinoid Feather Star Anneissia Japonica.", Mar Drugs., 2019, 17, DOI:10.3390/md17020136. 
7)Y. Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa, S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H.  Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y. Ozeki, "A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP kinases.", FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154. 

よくある質(zhì)問

Q

Labeling Kitで1次抗體を直接標(biāo)識(shí)する利點(diǎn)を教えてください。

A

はじめて抗體標(biāo)識(shí)をされる方を?qū)澫螭趣筏骏抓恁去偿毪蜃鞒嗓筏皮辘蓼埂?br /> カスタマーサポートの視點(diǎn)から直接標(biāo)識(shí)法の利點(diǎn)や実施例等を記載しておりますので、ご參照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗體標(biāo)識(shí)プロトコル ~カスタマーサポートの視點(diǎn)から~」

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか?

A

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質(zhì)が含まれるかを確認(rèn)の上、狀況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標(biāo)識(shí)反応にご使用ください。

<高分子:分子量1萬以上>
影響する可能性があります。
BSAやゼラチンなどアミノ基をもつ化合物が含まれると、抗體への標(biāo)識(shí)効率が低下します。また、高分子のためFiltration Tubeでも除くことができません。また、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標(biāo)識(shí)?精製操作に支障がでる可能性もあります。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。
*本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗體の精製について、小社抗體精製キット(下記)を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A   IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code:AP01もしくはAP02)

市販の抗體 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ(Collagenase)によるゼラチン分解

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: ゼラチン含有IgG溶液
2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬
?コラーゲナーゼ(Sigma, #C7826) 3.5 CDU/ml 希釈溶液
?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02)
?市販の抗體 200 μg
(2)精製方法
?0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調(diào)製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。
?37℃、3時(shí)間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※IgG Purification Kitでは、抗體を固定化擔(dān)體に保持させる際の抗體溶液量を一回當(dāng)たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗體溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを擔(dān)體に保持させる操作を8回(200 μl×7, 100 μl×1)に分けて行う。
※上記の方法で得られる抗體の回収率:45~50%
 

B. 300K 限外ろ過チューブを用いたゼラチン除去

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: IgG
2: ゼラチン含有IgG溶液
3: 300K限外濾過のみのIgG溶液
4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬
?300K フィルトレーションチューブ(Pall社 ナノセップ遠(yuǎn)心ろ過デバイス(製品コード:OD300C33)
?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02)
?市販の抗體 200 μg
(2)精製方法
?0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過を行う(200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g)。
?その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸著操作は5回繰り返す。
※上記の方法で得られる抗體の回収率:35~45%

 

Q

サンプルが溶液でも問題ないでしょうか?

A

溶液であること自體は問題ありません。
ただし、下記の點(diǎn)をご確認(rèn)いただいた上でご使用ください。
-濃度-
 サンプル濃度が0.5mg/ml以下(50μg/100μl以下)である場(chǎng)合には
 Filtration tubeを用いてサンプル量が50~200μgとなるように
 遠(yuǎn)心して濃縮を行ってください。
 フィルター上に殘ったサンプルは再溶解させる必要はありません。
 そのまま反応にご使用ください。

-溶液量-
 Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100μl以下でご使用ください。

-共存物-
 ?不溶性の低分子が含まれる場(chǎng)合は、予め遠(yuǎn)心して上清のみを使用してください。
 ?分子量10,000以上の物質(zhì)が含まれる場(chǎng)合には、別途精製を行ってからご使用ください。
  (市販の抗體の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場(chǎng)合があります)

Q

光による退色は起こりにくいのでしょうか?

A

當(dāng)社での確認(rèn)試験では、HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647ともにAlexaと同等の耐光性を示しています。

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

Q

低分子のタンパク質(zhì)(分子量50,000以下)に標(biāo)識(shí)する場(chǎng)合の方法を教えて下さい。

A

キット付屬のフィルトレーションチューブは分畫分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質(zhì)のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質(zhì)を標(biāo)識(shí)される場(chǎng)合は、下記のような分畫分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質(zhì)でもラベル化可能でございます。

——————————————
PALL社 ナノセップ  3K 製品No.OD003C33
PALL社 ナノセップ 10K 製品No.OD010C33 
——————————————

キット同梱のフィルターを用いた場(chǎng)合に比べ遠(yuǎn)心に時(shí)間を要することがございますので遠(yuǎn)心時(shí)間はご検討下さい。

Q

標(biāo)識(shí)後、フィルトレーションチューブを遠(yuǎn)心してもメンブレン上に液が殘る。

A

(1)メンブレンを目視で確認(rèn)した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が殘る程度であれば、次の操作に進(jìn)んで下さい。
メンブレン上に液が殘っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が垂れてくるようであれば、さらに遠(yuǎn)心を8,000g で15分~30分程度行って下さい。

(2)1)の遠(yuǎn)心操作後もメンブレン上に液が殘る場(chǎng)合は、標(biāo)識(shí)體が凝集していないか確認(rèn)してください。

抗體やタンパク質(zhì)自身の性質(zhì)によりますが、低分子標(biāo)識(shí)剤を標(biāo)識(shí)することで抗體やタンパク質(zhì)の疎水性が増し、凝集する場(chǎng)合がございます。

標(biāo)識(shí)體に凝集が見られる場(chǎng)合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠(yuǎn)心し上澄みをご使用ください。(抗體?タンパク質(zhì)の回収量は低下いたします。)

上記でも解決しない場(chǎng)合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。

※フィルターの目詰まりが疑われる場(chǎng)合は、メンブレンフィルターを新しいものに交換すると解決する場(chǎng)合がございます。
代替品: PALL社製 ナノセップ 30K (メーカーコード:OD030C33)

Q

IgG1分子に色素が幾つ標(biāo)識(shí)されますか?

A

IgG1分子あたり、3~7個(gè)の色素が標(biāo)識(shí)されます。
プロトコルや製品添付の説明書にも標(biāo)識(shí)率を計(jì)算する式を載せてあります。

HiLyte Fluor 555/タンパク質(zhì)の標(biāo)識(shí)率=[A555/150,000]/[(A280-A555x0.1)/ε]

A555:555nmの吸光度
A280:280nmの吸光度
ε:タンパク質(zhì)の280nmのモル吸光係數(shù)(IgGの場(chǎng)合には216,000)

Q

未反応の色素は除去できますか?

A

説明書にある反応後の2回の洗浄で、未反応色素の95%は除去されます。

必要であれば、WS buffer等での洗浄をさらに2~3回繰り返すことで未反応色素はほぼ除去されます。

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2  抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit - NH2 

取扱條件

取扱條件
1.保存方法:冷蔵, 2.吸濕注意
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