Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

01 細(xì)胞増殖/細(xì)胞毒性測定用試薬

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

• 細(xì)胞増殖/細(xì)胞毒性測定用試薬
• 細(xì)胞機(jī)能解析
• 細(xì)胞老化

老化細(xì)胞検出キット

• 製品コード
  SG03　 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

技術(shù)情報の目次

• 原理
• 蛍光特性（β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGal）
• 本キットを使用した論文
• キットの使用手順
• 特長①．生細(xì)胞も固定化細(xì)胞も適用できる
• 特長②．定量が容易にできる
• 一般的な老化細(xì)胞マーカー
• 異なる老化マーカーとの共染色
• 組織サンプル中のSA-β-gal検出
• T細(xì)胞(浮遊細(xì)胞)におけるSA-β-gal検出
• 細(xì)胞老化と細(xì)胞周期との関連性
• 共焦點定量イメージサイトメーターによる定量解析

技術(shù)や使用製品に関する補(bǔ)足

• 

  細(xì)胞周期測定試薬

  Cell Cycle Assay Solution Blue

• 

  ミトコンドリア膜電位検出キット

  JC-1 MitoMP Detection Kit

Q

1キット當(dāng)りの使用回數(shù)の目安は？

A

目安となる使用回數(shù)については、下記の容器毎の數(shù)量をご參考ください。

※１ウェル當(dāng)りに添加する染色溶液の量によって上記の數(shù)量は変わります。
　 使用する容器と必要な１ウェル當(dāng)りの染色溶液量を予め確認(rèn)の上、ご使用ください。

Q

Bafilomycin A1 を添加する理由を教えて下さい。

A

多くの細(xì)胞には內(nèi)在性のβ-ガラクトシダーゼの存在が知られていますが、SPiDER-βGalは、內(nèi)在性のβ-ガラクトシダーゼと老化マーカーであるSA-β-Galともに反応するため、老化が認(rèn)められていない細(xì)胞でも、バックグラウンドが高くなり、SA-β-Galの検出に支障が出てきます。
Bafilomycin A1は、リソソーム中のATPase活性を阻害し、リソソーム中のpHを酸性から中性付近に変化させますが、この作用により內(nèi)在性β-ガラクトシダーゼの活性が低下します。そのため、SPiDER-βGalを添加する前にBafilomycin A1で細(xì)胞を処理することで、SPiDER-βGalはSA-β-Galと反応して老化細(xì)胞を蛍光染色することができます。

左図ではBafilomycin A1の添加有無によるSA-β-Gal検出の違いを示しています。

なお、Bafilomycin A1は、オートファジー阻害剤としての利用も知られています。ご利用の際は、実験系に支障があるかご検討の上、支障が有る場合は、固定化細(xì)胞の利用をお勧めします。固定化細(xì)胞を用いる場合は、バッファーで細(xì)胞內(nèi)pHをコントロールするため、Bafilomycin A1 は使用しません。取扱説明書に記載された手順に従って染色することができます。

Q

DMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか？

A

SPiDER-βGal DMSO stock solution及びBafilomycin A1 DMSO stock solution調(diào)製後は、-20℃保存した場合に1か月間安定であることを確認(rèn)しています。

Q

Working solutionは、どのくらい安定ですか？

A

SPiDER-βGal working solution及びBafilomycin A1 working solutionは保存できないため、用時調(diào)製して下さい。

Q

老化細(xì)胞を蛍光観察する際の注意點はありますか？

A

細(xì)胞老化が進(jìn)むと細(xì)胞內(nèi)にリポフスチンと呼ばれる不溶性物質(zhì)が蓄積してきます。リポフスチンは自家蛍光を発するため蛍光観察時にバックグラウンドとして影響することがあります。その場合、老化細(xì)胞中のSA-β-gal活性を正確に評価するために、SPiDER-βGalを添加しない試料もご用意いただき確認(rèn)することをお勧めします。

○フローサイトメーターの場合
?「老化細(xì)胞」および「老化していない細(xì)胞」を用いて、各々①②の平均蛍光強(qiáng)度(MFI)を測定してください。
　　　①SPiDER-βGalを添加した細(xì)胞
　　?、赟PiDER-βGalを添加していない細(xì)胞（バックグラウンド）

?「①の平均蛍光強(qiáng)度」から「②の平均蛍光強(qiáng)度」を差し引いてください。
　バックグラウンドを差し引いたSA-β-gal由來の蛍光強(qiáng)度をSA-β-gal活性の指標(biāo)とします。
　　　a：SA-β-gal活性（老化細(xì)胞）　　　　　 = ①の平均蛍光強(qiáng)度?。、冥纹骄w光強(qiáng)度
　　　b：SA-β-gal活性（老化していない細(xì)胞） = ①の平均蛍光強(qiáng)度?。、冥纹骄w光強(qiáng)度

?上記の aおよびb の値を比較することで、SA-β-gal活性として評価してください。
   また、上記のaからbを差し引くことで細(xì)胞老化に伴うSA-β-gal活性の変化を確認(rèn)できます。

○蛍光顕微鏡の場合
?初めにSPiDER-βGalを添加していない老化細(xì)胞を用いて蛍光観察してください。
?リポフスチン由來の蛍光像（バックグラウンド）が影響を與えない程度に感度（gainなど）を調(diào)整してください。
?その後、同じ撮影條件でSPiDER-βGalを添加した細(xì)胞や老化していない細(xì)胞の蛍光観察を行い評価してください。

Q

細(xì)胞を固定化した後に、SA-β-galは染色できますか？

A

可能です。固定化した場合、Bafilomycin A1を用いた細(xì)胞の前処理は必要ありませんが、pH6.0に調(diào)整したMcIlvain bufferを別途準(zhǔn)備して頂く必要があります。詳細(xì)は取扱説明書をご覧ください。

Q

固定化細(xì)胞をフローサイトメーターを用いて検出するプロトコルを教えて下さい。

A

下記のプロトコルを參照ください。

(1) 細(xì)胞を35 mmディッシュに播種し、37℃、5% CO²インキュベーターで一晩培養(yǎng)する。
(2) 培地を吸引除去し、HBSS 2 mlで1回洗浄する。
(3) トリプシンで細(xì)胞を剝がし、培地500 μlで回収する。
(4) 300×gで5分間遠(yuǎn)心し、上澄みを除去する。
(5) 2% PFA/PBS 100 μlに懸濁し、室溫で5分間固定する。
(6) 300×gで5分間遠(yuǎn)心し、上澄みを除去する。
(7) HBSS 500 μLに懸濁し、300×gで5分間遠(yuǎn)心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(8) SPiDER-βGal working solution(固定化細(xì)胞用) 500 μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。
　　 ※pHの変動を抑えるため、5% CO₂インキュベーターは使用しない。
(9) 300×gで5分間遠(yuǎn)心し、上澄みを除去する。
(10) HBSS 500 μlに懸濁し、300×gで5分間遠(yuǎn)心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(11) HBSS 500 μlを加えて細(xì)胞を回収し、フローサイトメーターにて解析する。

Q

細(xì)胞を固定化後にSA-β-gal検出および免疫染色はできますか？

A

はい、染色は可能ですが、細(xì)胞を固定化するとSA-β-galが低下する可能性があります。 （下記の^※2に注意事項を記載）
以下の実験例を參照しご検討ください。

WI-38細(xì)胞を固定化後に、SA-β-gal検出およびγ-H2AX（DNA損傷マーカー）の免疫染色を行った。

＜実験操作＞

(1)	WI-38細(xì)胞を35 mm dishに播種し、37℃、5% CO2インキュベーターで一晩培養(yǎng)した。
(2)	培養(yǎng)上清を除き、4% Paraformaldehyde/PBS溶液2 mlを細(xì)胞に添加し、室溫で3分間インキュベートした※1。
(3)	PBS 2 mlで細(xì)胞を3回洗浄した。
(4)	SPiDER-βGal working solution ※2 2 mlを添加し、37℃で30分間インキュベートした※3。
(5)	PBS 2 mlで細(xì)胞を2回洗浄した。
(6)	0.1% Triton X-100/PBS 2 mlを細(xì)胞へ添加し、室溫で30分間インキュベートした。
(7)	PBS 2 mlで2回洗浄した。
(8)	1% BSA/PBS溶液2 mlを細(xì)胞へ添加し、室溫で1時間インキュベートした。
(9)	抗γ-H2AX IgG (マウス由來)を1% BSA/PBS溶液にて希釈後、細(xì)胞に添加し4℃で一晩インキュベートした。
(10)	PBS 2 mlで細(xì)胞を3回洗浄した。
(11)	抗マウスIgG(Cy5標(biāo)識)を1% BSA/PBSで希釈後、細(xì)胞に添加し室溫で1時間インキュベートした。
(12)	上清を除き、PBS 2 mlで細(xì)胞を2回洗浄し蛍光顕微鏡下で観察した。
※1	固定化時間を長くすると、SA-β-gal活性が低下します。
※2	細(xì)胞の固定化操作によりSA-β-gal活性が低下する可能性があります。 もしSA-β-gal評価時に十分な蛍光強(qiáng)度が得られない場合は、SPiDER-βGal DMSO stock solution を500-1000倍に希釈しご使用ください。通常はSPiDER-βGal DMSO stock solutionをMcIlvaine buffer（pH 6.0）にて2,000倍の希釈を推奨。 希釈倍率の異なるSPiDER-βGal working solutionの結(jié)果をFig.1に示す。
※3	インキュベートの際は、5% CO2インキュベーターでは行わないこと。5% CO2インキュベーター內(nèi)に固定化した細(xì)胞をおくと、バッファーが酸性になることで內(nèi)在性のβ-galactosidase活性が上昇することが考えられる。結(jié)果として、バックグラウンドが上昇し、老化細(xì)胞と若い細(xì)胞のSA-β-gal活性の差が見えにくくなる。

 

＜実験データ＞

図1 免染前後におけるSPiDER-βGal染色の蛍光強(qiáng)度変化

免疫染色の前後でSPiDER-βGalの蛍光強(qiáng)度を比較すると、固定化を行う免疫染色の過程でSPiDER-βGalの蛍光強(qiáng)度が低下していることを確認(rèn)した。
 

図2 希釈倍率の異なるSPiDER-βGalによる染色例（免疫染色後） 　赤： SPiDER-βGal、青： γ-H2AX?。悸豆鈺r間: 1.5 sec＞

SPiDER-βGal working solutionの希釈倍率を2000倍から666倍に変更することで、免疫染色（固定化）により低下したSPiDER-βGalの蛍光強(qiáng)度が免疫染色前と同程度の強(qiáng)度を示すことを確認(rèn)した。

Q

染色後の蛍光が弱くて確認(rèn)できないのですが、対策を教えてください。

A

下記の3點についてご確認(rèn)またはご検討ください。

①ご使用のフィルターが試薬の蛍光特性に合致している。
?。纪茒Xフィルター＞
　　?蛍光顕微鏡：　勵起（500-540 nm）, 蛍光（530-570 nm）
　　?フローサイトメーター：　勵起（488 nm）, 蛍光（500-540 nm）
　
②各working solutionは用時調(diào)製したものを使用する。

③染色時間を長くする。
　SPiDER-βGal working solution添加後、30分間のインキュベーションで蛍光が確認(rèn)できない場合は、インキュベーション時間を45-60分間を目安にご検討ください。

Q

SA-β-Gal発現(xiàn)細(xì)胞を染色後、細(xì)胞は固定化できますか？

A

可能です。4%パラホルムアルデヒドを用いて固定化することを推奨します。

Q

培地中の血清やフェノールレッドは検出に影響しますか？

A

培地中の血清およびフェノールレッドは、SA-β-galの検出には影響しません。

Q

老化細(xì)胞とコントロール細(xì)胞で蛍光強(qiáng)度に差がない場合、何を確認(rèn)したら良いですか？

A

STEP1:顕微鏡の観察條件を最適化してください。
STEP2:観察條件を最適化しても解決しない場合、染色條件の最適化を行ってください。

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STEP1＜顕微鏡の観察條件を最適化＞

コントロール細(xì)胞の蛍光と老化細(xì)胞の蛍光に差が見られない場合下記をご確認(rèn)ください。

?コントロール細(xì)胞を観察し蛍光が僅かに確認(rèn)できる條件までGain、レーザー強(qiáng)度を下げる、または露光時間を短くする。
(共焦點顕微鏡：Gain、レーザー強(qiáng)度の調(diào)整　落射型顕微鏡：露光時間の調(diào)整)

?老化細(xì)胞の蛍光を観察し、コントロール細(xì)胞との蛍光の差を確認(rèn)する。

?蛍光の差がみられない場合はSTEP2を確認(rèn)する。

※観察する部分がガラスボトムシャーレの容器をお使いください。

顕微鏡観察條件とコントロールおよび老化細(xì)胞の蛍光強(qiáng)度の関係

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STEP2＜染色條件の最適化＞

細(xì)胞によっては、SPiDERの染色時間もしくは濃度の検討が必要な場合がございます。
以下を目安に最適條件をご検討ください。
染色時間：10分～60分
染色濃度：取扱説明書に記載の濃度の1/2量～2倍量

※観察する細(xì)胞數(shù)が少ないと感度が得られない場合がございます。
　必要に応じて、細(xì)胞數(shù)の最適化を行ってください。

染色條件とコントロールおよび老化細(xì)胞の蛍光強(qiáng)度の関係

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。