SOD Assay Kit – WST

02 酸化ストレス関連試薬

SOD Assay Kit – WST

• 酸化ストレス関連試薬
• 食品機(jī)能評(píng)価

抗酸化能測(cè)定キット

• 製品コード
  S311　 SOD Assay Kit – WST

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• お問(wèn)い合わせ

マニュアル

Q

SOD様活性と試薬の発色の関係について教えてください。

A

SOD様活性が強(qiáng)いと試薬の発色は弱くなります。また、SOD様活性が弱いと試薬の発色は強(qiáng)くなります。下記をご參照ください。

＜キットの原理＞

WST-1はスーパーオキサイド（以下、2O₂^–）によって還元されることで、WST-1 formazanに変化し発色します。SOD様活性を持つ物質(zhì)がサンプル中に存在するとキサンチンオキシダーゼ（XO）を介して発生する2O₂^–を除去しますので、還元されるWST-1の量が少なくなります。2O₂^–がWST-1の還元に使われるか、SOD様活性により除去されるかの競(jìng)爭(zhēng)反応により発色の度合いが変化します（下図）。併せて製品ページの「技術(shù)情報(bào)：測(cè)定原理」もご參照ください。

?SOD様活性が弱い場(chǎng)合

 

?SOD様活性が強(qiáng)い場(chǎng)合

Q

Mn-SODとCu, Zn-SOD 及びEC(extracellular)-SODの測(cè)り分けはできますか？

A

サンプル溶液にKCN（potassium cyanide）またはDDC（Diethyldithiocarbamate）を添加することでCu, Zn-SOD 及びEC(extracellular)-SODの活性を阻害し、Mn-SOD の活性が測(cè)定できます。

【測(cè)定例】
?SODのサンプル溶液にKCNまたはDDCを終濃度が1-10 mmol/l となるように添加し、室溫にて5分間インキュベートする。
?インキュベート後の溶液（20 μl）を用いて、SOD Assay Kit-WSTのマニュアルに従ってSOD様活性を測(cè)定する。

*注意點(diǎn)*
?KCNやDDCの濃度およびインキュベーション時(shí)間は、サンプルによって検討が必要となります。下記の論文を參考してください。
?ユニット（U）算出の際は、KCN又はDDC添加により希釈されたサンプルの希釈倍率を考慮して計(jì)算して下さい。

1) Greenough MA, Volitakis I, Li QX, Laughton K, Evin G, Ho M, Dalziel AH, Camakaris J, Bush AI, “Presenilins promote the cellular uptake of copper and zinc and maintain copper chaperone of SOD1-dependent copper/zinc superoxide dismutase activity”, J Biol Chem., 2011, 286, 9776.

2) Hajime Fujimoto, Jun-ichi Taguchi, “Manganese superoxide dismutase polymorphism affects the oxidized low-density lipoproteininduced apoptosis of macrophages and coronary artery disease.”, European Heart Journal. 2008. 29, 1267.

3) A. Dacanay, S. C. Johnson, R. Bjornsdottir, R. O. Ebanks, N. W. Ross, M. Reith, R. K. Singh, J. Hiu, and L. L. Brown, "Molecular Characterization and Quantitative Analysis of Superoxide Dismutases in Virulent and Avirulent Strains of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida"Journal of Bacteriology, 2003, 185 (15), 4336.

1) Heikkila RE, Cabbat FS, Cohen G. “In vivo inhibition of superoxide dismutase in mice by diethyldithiocarbamate”, J Biol Chem., 1976, 251, 2182.

Q

SODキットを使用して、測(cè)定した際の[unit]算出の方法はどのようにすればよいのでしょうか？

A

 SOD活性の定義としましては、チトクロムｃ法の時(shí)も同様ですが、「IC50=1U:発色を50％阻害する時(shí)のSODの活性を示す?jié)舛取工摔胜辘蓼埂?/p>

このキットでの1Uの定義は、「WSTの発色を50%阻害する時(shí)のSODの活性」です。
従って、サンプルを希釈していき、IC50の時(shí)の希釈倍率のSODの活性が1Uです。

「U」は「単位」ですので、これを「量」に換算します。

この時(shí)、タンパク量を容量で算出するのか、重量で算出するのかで、1U/mlもしくは1U/mg proteinと表示します。

カタログに記載している阻害曲線は、活性既知のSODを希釈し測(cè)定しています。
たまたまIC50値が1U/ml付近になっています。

<50％阻害するサンプル濃度を1Uとする方法：ユニットをWST法として表現(xiàn)>
例：サンプルのIC50値の希釈倍率を x10.75　とする。

（このキットでは測(cè)定に使用するサンプル量が20μl、全量が240μl）

IC50を示す測(cè)定時(shí)のサンプル希釈率は「10.75倍」になります。
　–>『10.75倍に希釈された液、「20 μl中」に存在する SOD 量が1単位である』
　となります。

単位で考えると、測(cè)定時(shí)のものが「１U」ですので、希釈前サンプルは「10.75U」　となります。

アッセイで添加したのは20 μ （0.02 ml)ですので、サンプル 1 mlあたりのunit數(shù)を計(jì)算する。

アッセイで添加する20 μl中に1単位含まれるので
10.75/0.02 = 537.5 U/ml

SOD抽出過(guò)程（前処理）で希釈が生じていれば、元々の試料の活性は前処理での希釈を計(jì)算して
希釈率ｘ537.5 = ○ U/ml of サンプル

となります。

＊ここでは容量に換算しております。
　例えば：血液であれば　「○ U/ml of blood」など
　タンパク量や質(zhì)量(mg)に換算したい場(chǎng)合は、さらに別途換算してください。

Q

酸化ストレスの指標(biāo)としてSOD様活性はよく測(cè)定されますが、 SOD様活性の他に酸化ストレスマーカーとなるものはありますか？

A

酸化ストレスマーカーについてまとめた資料を作成しております。
カスタマーサポートの視點(diǎn)から、各酸化ストレスマーカーの特徴?測(cè)定サンプルの前処理方法などを記載しておりますので、ご參照ください。

下記URLよりダウンロード可能です。

「はじめての酸化ストレスマーカー測(cè)定プロトコル～カスタマーサポートの視點(diǎn)から～」

Q

SOD様活性を測(cè)定する方法としてはどのようなものがありますか？

A

一番一般的に知られている方法は
?チトクロムｃ法

　です。その他

?NBT法

?エピネフリン法

?亜硝酸法

?ESR法

などが知られております。

NBT法はx(chóng)anthine/xanthine oxidaseをスーパーオキサイド産生系とし、テトラゾリウム塩の還元反応を利用しており、操作が簡(jiǎn)便であることから汎用されております。

しかし、生成するホルマザンが不溶性の沈殿物であることやNBTがxanthine oxidaseと直接反応することから100％阻害率を測(cè)定できないなどの問(wèn)題がありました。

弊社のWST法は、発色基質(zhì)として「WST-1」を使用しこれらの問(wèn)題を解決しております。

（測(cè)定原理はNBTと同様とお考え下さい）

Q

superoxideとWST-1の反応の阻害が０（発色が100％）となるところが全く発色しません。酵素(Xanthine oxidase)が失活しているのでしょうか？

A

酵素(Xanthine oxidase)は失活していなくても、働いていない場(chǎng)合があります。酵素溶液は懸濁液になっていますので靜置して置くと酵素が沈んでしまいます。良く振ってからご使用ください。上澄みだけを取ってしまうとsuperoxideは全く発生しませんので発色もしません。
 

Q

脂溶性成分は測(cè)定できますか？

A

本キットは水溶性サンプルの測(cè)定を主な対象としており、水に溶解できないサンプルは測(cè)定出來(lái)ません。なお、脂溶性物質(zhì)を低濃度域で溶解可能な場(chǎng)合は、DMSOやエタノールに一度溶解後、蒸留水やPBSで出來(lái)る限り希釈し、測(cè)定してください。
注意①サンプル中にDMSOは5%、エタノールは25%含まれますと測(cè)定に影響します。溶媒濃度を測(cè)定に影響しない濃度まで希釈しご使用ください。

注意②検討の際は、必ずBlank2とBlank3を測(cè)定し、誤発色等の影響がないかご確認(rèn)ください。

Q

SOD Assay Kit – WSTは食品等の測(cè)定も可能となっておりましたが、 必要な前処理の方法を教えて下さい。

A

下記のような方法により処理し、測(cè)定を行うことが出來(lái)ます。

<茶葉>
茶葉資料10 gに蒸留水400 mlを加えてホモジナイズ処理し、5 ℃で48時(shí)間靜置して抽出し、ろ過(guò)(No.2:アドバンテック東洋(株))した後、さらにメンブレンフィルター(pore size 0.45μm:富士フィルム(株))で処理する。
<ワイン>
直接メンブランフィルターでろ過(guò)し、測(cè)定試料とする。
緑茶や赤ワイン等はそのもの自體に著色がありますが、100倍程度に希釈すると測(cè)定に対する色の影響は回避できます。
<植物?野菜類>
1)蒸留水(野菜の重量に対し5倍量程度）で4 ℃、1分間ホモジナイズする。
2)ホモジネートをろ紙でろ過(guò)し、ろ液(水での抽出物）を凍結(jié)乾燥する。
3)凍結(jié)乾燥したものを0.1 mol/lリン酸バッファー(pH7.4)に溶かし、これを測(cè)定試料とする。溶かしたものはなるべく早く使用する。
＊上記試料により得られた活性値は、水による抽出物の凍結(jié)乾燥後の重量もしくはホモジナイズ前の野菜重量當(dāng)りの活性値とする。

【參考文獻(xiàn)】
日本食品科學(xué)工學(xué)會(huì)誌,2002, 49(1),25～31.
日本食品科學(xué)工學(xué)會(huì)誌,2002, 49(10),679～682.

-注-
食品中にはキットのに使用している色素を直接発色させてしまう還元物質(zhì)が多く存在します。これまで得られている報(bào)告では20～100倍に希釈する事によりその影響を押さえることが出來(lái)ております。

Q

測(cè)定に影響を與える物質(zhì)にはどのようなものがありますか？

A

アスコルビン酸、グルタチオン(還元型)など還元性物質(zhì)は正誤差を與えます。
これらの物質(zhì)が下記の濃度存在した場(chǎng)合10％程度の吸光度の上昇が認(rèn)められますが、
吸光度の上昇は[blank2]として差し引くことにより影響は回避できます。
?ascorbic acid：0.1 mmol/l

?glutathione,reduced form：5 mmol/l

?bovine serum albumin(BSA)：5% w/v

（BSAは吸光度の上昇は見(jiàn)られませんが、SOD様活性を示しますのでこれよりも高濃度にならないようにして下さい）

Q

組織の前処理に使用するショ糖緩衝液はどのように調(diào)製すればよいですか？

A

下記の調(diào)製例をご參照ください。

＜ショ糖緩衝液 1000mlを調(diào)製する場(chǎng)合＞

試薬	使用量（モル濃度）
ショ糖	85.57 g（0.25 mol/l）
2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol （トリス緩衝剤）	1.21 g（0 mmol/l）
2NA(EDTA?2Na)	372 mg（1 mmol/l）

上記3種類の試薬を800 ml程度の純水に加えて溶解させ、攪拌しながら塩酸を加えてpH 7.4に調(diào)整する。
その後、純水を加え全量1000 mlとする。

 

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。