新型親和法外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS

 

　　MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸（PS）親和Tim4蛋白固化磁珠（PS親和法）的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高純度的外泌體，請使用10,000×g離心后的上清。

　　該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來，所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實(shí)驗(yàn)，包括電鏡分析（TEM）、納米粒子追蹤（NTA）分析、投喂實(shí)驗(yàn)、分子組成（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等）分析等。

 

◆膜表面磷酯酰絲氨酸（PS）親和法

　　Tim4蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細(xì)胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脫液進(jìn)行洗脫，捕獲高純度的完整細(xì)胞外囊泡

◆優(yōu)點(diǎn)?特色

 

 

使用新型親和提取方法

●　通過PS親和分子回收 ●　低背景值 ●　在中性條件下通過螯合試劑進(jìn)行溫和洗脫 ※　可獲得高純度，完整的外泌體

無需進(jìn)行超離

●　使用磁珠改進(jìn)了操作

●　流程優(yōu)化

※　高重復(fù)性

與其他提取方法相比
方法	外囊泡純度	囊泡狀態(tài)	可操作性	回收量
PS親和法	■■■	完整	簡便穩(wěn)定	■■■
超速離心法	■■	完整	簡便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	簡便快捷	■■■■
密度梯度離心法	■■■■	完整	復(fù)雜	■■
抗體親和法	■■■	不完整	簡便穩(wěn)定	■■

樣品類型：細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、尿液等。

●　可以純化高純度和完整的細(xì)胞外囊泡

●　可以從細(xì)胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡

●　重復(fù)性高，回收量穩(wěn)定

●　簡易操作（約3.5小時）

●　啟用多個樣品（無需超速離心）

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品名稱	包裝規(guī)格		保存條件
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	10次 （產(chǎn)品編號：293-77601）	2次 （產(chǎn)品編號：299-77603）	2-10°C
試劑盒成分 (1) 鏈霉親和素磁珠 (2)生物素標(biāo)記的外泌體捕獲 (3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液 (4)外泌體結(jié)合增強(qiáng)劑(×500) (5)洗滌緩沖液 (6)外泌體洗脫緩沖液 (7)反應(yīng)管	<10 次>  600 μL×1 管  100 μL×1 管  35 mL×1 瓶  500 μL×1 管  75 mL×2 瓶  5 mL×1 瓶  22 管	<2 次>  120 μL×1 管  20 μL×1 管  7 mL×1 瓶  100 μL×1 管  30 mL×2 瓶  1 mL×1 瓶  1 管

 *每套試劑盒能完成5次回收實(shí)驗(yàn)，即實(shí)際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit

◆案例?應(yīng)用

從血清、血漿、尿液中提取的細(xì)胞外囊泡的分析

從人血清中提取外泌體的產(chǎn)量比較

　　使用該試劑盒，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用CD9和CD63抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

●　檢測抗體

      抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

      各樣品結(jié)果相當(dāng)于150μL的血清樣本。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

從人EDTA血漿中提取外泌體

　　分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進(jìn)行WB檢測（抗Flotillin2抗體）。

●　檢測抗體

      抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用樣品量

      各1mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

      各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

　　1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進(jìn)行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗CD9抗體）。

●　檢測抗體

      抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用樣品量

      各1mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

      各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150μL尿液樣品。從100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

◆與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實(shí)驗(yàn)

　　分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】

　　按照試劑盒的操作說明（反應(yīng)時間：3小時），從1mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。

超速離心法

　　將10mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）進(jìn)行超離（110,000×g，70min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進(jìn)行超離（110,000×g，70min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　從1mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。

※1：110,000×g離心2小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果

　　分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（2~4×10¹⁰ particles），在透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。

電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生

MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到很多細(xì)胞外囊泡。

 

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）

　　用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳。接著用銀染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

回收量，不是回收率

●　檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2 小鼠單抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

 

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10%FBS-添加培養(yǎng)基）

　　用MagCapture™外泌體提取試劑盒 、超離法和聚合物沉淀法，從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS補(bǔ)充培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳，用銀染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時，對外泌體提取片段進(jìn)行質(zhì)譜測定，比較所有測定的多肽中來自K562細(xì)胞的人來源多肽的比例（由于添加到細(xì)胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）。

●　檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

     健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

①運(yùn)用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產(chǎn)量。

②運(yùn)用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

　　運(yùn)用PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

對比AGPC法，使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

<實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果>

　　分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含10% FBS（不含外泌體）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質(zhì)條帶。然后在凝膠內(nèi)進(jìn)行消化，用LC-MS對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組合的相關(guān)性比較。

比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質(zhì)

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質(zhì)

灰色柱：來自FBS的牛蛋白污染物

紅 色：來自外囊泡的標(biāo)記蛋白

樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)基（含有10%去除外泌體胎牛血清）

	PS親和法	超離法	聚合物沉淀法
1	71kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)	補(bǔ)體C3 (Complement C3)
2	膜聯(lián)蛋白A6 (Annexin A6)	鐵轉(zhuǎn)蛋白受體1 (Transferrin receptor protein1)	α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin)
3	鐵轉(zhuǎn)蛋白受體1 (Transferrin receptor protein1)	血清白蛋白 (Serum albumin)	纖連蛋白 (Fibronectin)
4	V-ATP酶A亞基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A)	ATP依賴RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A)	血清白蛋白 (Serum albumin)
5	浮艦蛋白-2 (Flotillin-2)	微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain)	血小板反應(yīng)蛋白-1 (Thrombospondin-1)
6	程序性細(xì)胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)	71kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	補(bǔ)體C4 (Complement C4)
7	細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain )	脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase)	α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase)
8	膜聯(lián)蛋白A1 (Annexin A1)	細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain)	載脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100)
9	220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)	U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)	胎兒血紅蛋白亞單位 (Hemoglobin fetal subunit beta)
10	膜聯(lián)蛋白A2 (Annexin A2)	β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain)	β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain)

成對組合相關(guān)性比較

 

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質(zhì)濃度

　　Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測法中最通用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì)Cu²⁺離子被還原為Cu⁺。Cu⁺與BCA形成絡(luò)合物，即產(chǎn)生紫色螯合物，蛋白質(zhì)濃度與紫色螯合物顏色深淺有關(guān)，通過測定562nm處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。

利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果】

　　將通過MagCapture™外泌體提取試劑盒提取的25μL外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200μL。之后60℃孵育30分鐘，檢測560nm吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度的檢測

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌體蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)?shù)?，因此BCA測定時不要稀釋樣品。

①    將BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白對照，分別每孔25μL加到96孔板中。

②    分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號：297-73101）的試劑A盒試劑B混合液（A:B=50:1）加入放有樣品的孔板中。

④    60℃孵育30分鐘

⑤    室溫條件下降低孔板溫度

⑥    測定560nm的吸光度

 

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	包裝
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白測定試劑盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1mL×10

 

◆外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)

【實(shí)驗(yàn)概要】

用PKH67（Sigma公司）標(biāo)記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細(xì)胞外囊泡， Hela細(xì)胞導(dǎo)入確認(rèn)

<外泌體PKH67標(biāo)記>

1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取外泌體）

2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度

3. 將相當(dāng)于5μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5mL管中。

*請配制合適的使用量

4. 將2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*請配制合適的使用量

5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育5-10分鐘。

6. 根據(jù)附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。

7. 將100μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱*中，離心（最大添加量：100μL）。

*準(zhǔn)備必需的支數(shù)。

8. 將外泌體溶液*加入到已經(jīng)接種好Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

*根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)外泌體添加量

圖1. PKH標(biāo)記外泌體的細(xì)胞捕獲觀察

從16mL K562培養(yǎng)上清液中超濾濃縮得到4mL培養(yǎng)上清液作為樣品，通過PS親和法提取外泌體。

●      提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度：22.3ng/μL

●      粒子濃度：1.2×10⁸ particles/mL

將上述標(biāo)記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細(xì)胞中，24小時后用熒光顯微鏡（左）和流式細(xì)胞儀（右）檢測捕獲情況。

Opti-MEM：取相同量用PKH標(biāo)記后添加到細(xì)胞中作為陰性對照。

 

◆細(xì)胞培養(yǎng)上清?血清?血漿的預(yù)處理操作

　　樣品預(yù)處理：對樣品進(jìn)行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進(jìn)行10,000×g離心操作※2。

　　下文是細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的預(yù)處理方法。其他體液樣品的預(yù)處理操作，請參考血清/血漿的實(shí)驗(yàn)步驟，做適當(dāng)調(diào)整。

更換緩沖液（限制過濾）操作

用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經(jīng)經(jīng)過離心處理的EDTA 血漿樣品進(jìn)行緩沖液更換。

1. 把19 mL TBS 加進(jìn)VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，

　混勻。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下進(jìn)行離心處理。

4. 減少上線的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

5. 4℃下離心處理。

6. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

7. 4℃下離心處理。

8. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 緩沖液。

9. 4℃下離心處理直至樣品液量達(dá)到1 mL 以下。

10. 進(jìn)行提取。

 

◆MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟

 

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新型親和性外泌體純化法與外泌體高靈敏度檢測應(yīng)用

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PS親合法

　　通過使用T細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白域包含蛋白4（Tim4）分離高度純化的外泌體。Tim4是在巨噬細(xì)胞上表達(dá)的I型跨膜蛋白，其強(qiáng)烈結(jié)合磷酯酰絲氨酸，不僅顯示在凋亡細(xì)胞上，而且顯示在外泌體和微泡。使用Tim4蛋白，其特異性結(jié)合顯示在外泌體表面上的磷酯酰絲氨酸。因?yàn)榻Y(jié)合是Ca²⁺依賴性的，完整的外泌體可以通過添加Ca²⁺螯合劑容易地從Tim 4釋放。值得注意的是，利用PS親和法提取的外泌體純度之高可以用過質(zhì)譜顯示的。還用于從細(xì)胞條件培養(yǎng)基沉淀中分離大外泌體和通過ELISA、流式細(xì)胞術(shù)對外泌體的靈敏定量。這些結(jié)果表明通過Tim4蛋白純化的有用性表征Evs的真正功能。

（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）

和光外泌體提取試劑盒宣傳頁	Wako外泌體英文版說明書.pdf
成功研發(fā)提取高純度外泌體方法	外泌體提取試劑盒中文說明書

操作流程

樣品制備流程（步驟1）

外泌體捕獲固定流程（步驟2）

親和提取流程（步驟3—5）

外泌體提取血漿樣品前處理步驟

使用TBS緩沖液進(jìn)行緩沖液交換

1、向VIVASPIN 20（100K）中添加19mL TBS緩沖液。

2、將1ml血漿添加到（步驟1）的VIVASPIN 20（100K）中并混合。

3、離心（步驟2）中的VIVASPIN 20（100K）。 （離心條件參考使用說明書）

4、當(dāng)上層液體下降時，添加10mL TBS緩沖液到（步驟3）的VIVASPIN 20（100K）中。

5、離心。

6、當(dāng)上層液體下降時，添加10mL TBS緩沖液到（步驟5）的VIVASPIN 20（100K）中。

7、離心。

8、當(dāng)上層液體下降時，添加11mL TBS緩沖液到（步驟7）的VIVASPIN 20（100K）中。

9、離心VIVASPIN 20（100K），直到樣品體積變?yōu)?mL。

該方案共計使用50mL的TBS緩沖液。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

常見問題

?　關(guān)于試劑盒的規(guī)范、性能

Q1　本試劑盒使用了抗體嗎？

Ａ1　沒有使用抗體。使用了與金屬離子結(jié)合和與磷酯酰絲氨酸（PS）結(jié)合的蛋白。

 

Q2　用此款試劑盒可提取什么樣的細(xì)胞外囊泡呢？

Ａ2　外泌體和大型細(xì)胞外囊泡（微小泡）。

Q3　外泌體和微泡的區(qū)別是？

Ａ3　外泌體，是來源于晚期胞內(nèi)體，直徑為40-100nm的細(xì)胞外囊泡。微泡來源于細(xì)胞膜，直徑100-1000nm的細(xì)

　     胞外囊泡。

 

Q4　外泌體和微泡能可以分別純化嗎？

Ａ4　可以。同時純化的情況下，1200×g離心取上清液。純化外泌體的情況下，10000×g離心取上清液。只純化微

         泡的情況下，10000×g離心，沉淀置于TBS制成懸濁液備用。樣品的前處理請參考操作說明書。

 

Q5　外殼型病毒也能回收嗎？

A5　能。外殼性病毒膜表面也有PS，混入外殼性病毒的樣品，所有PS都能回收。需要分離的情況下，使用本試劑盒

        回收后，需要用與病毒或者外泌體特異性抗原的抗體純化。

 

Q6　所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸（PS）嗎？

A6　尚未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過分析外泌體的膜脂成分證實(shí)，有幾種細(xì)胞（小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞）來源于外泌體。因

        此，不會暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌體，而此款試劑不能純化這種外泌體。但是，使用

        該試劑純化到的外泌體，已確認(rèn)有多個外泌體標(biāo)記蛋白，與以單一類型的表面標(biāo)記蛋白作為抗原的傳統(tǒng)親和方

        法相比，以膜脂成分為抗原的該試劑能取得更多種類的外泌體。另外，雖然識別表面標(biāo)記蛋白的抗體可能無法

        識別不同動物來源的抗原，但是該試劑能解決這一問題（人類、小鼠、牛等都能應(yīng)用）。而且已驗(yàn)證了可以純

        化超速離心時需沉淀才能回收的外泌體。

 

Q7　該試劑盒的樣品是什么？

A7　使用細(xì)胞培養(yǎng)上層清液、血清或尿液效果顯著。如果血漿中添加了螯合劑（比如EDTA）和檸檬酸，原理上無

        法分離外泌體。若要回收，可通過超濾更換緩沖液來回收。具體步驟請看相關(guān)資料。由于肝素處理過的血漿回

        收率低，從血液樣本中回收請使用血清。另外有客戶成功從血漿、腦脊髓液中回收外泌體。

 

Q8　一次能回收多少外泌體？

A8　根據(jù)樣品的種類和數(shù)量有很大的差異，據(jù)研究所實(shí)驗(yàn)記錄，在一次的分離中最多能回收30μg蛋白質(zhì)（通過

        BCA法檢測）、1-2×10¹⁰粒子（通過納米技術(shù)檢測）。（K562培養(yǎng)基中的莫能菌素能促進(jìn)外泌體分泌，可取

        5mL培養(yǎng)上清液進(jìn)行回收）。

        1 mL正常人混合血清能回收5×10⁹顆粒（通過納米技術(shù)檢測）。

 

?　與傳統(tǒng)法的比較

Q9　與超速離心法相比好處在哪？

A9　與超速離心法相比，本試劑盒能更簡便、重復(fù)性好、高效地回收高純度外泌體。也能回收超速離心法無法沉淀

        的外泌體。

 

Q10　與傳統(tǒng)抗體親和法相比，PS親和的優(yōu)勢是什么？

A10　采用傳統(tǒng)的抗體親和法是用變性劑進(jìn)行洗脫，此款試劑盒是在中性環(huán)境下用螯合劑來洗脫的，能完整回收外

          泌體，不會混入非特異性吸附物，能獲得高純度外泌體，提取純度更高。傳統(tǒng)的抗體親和法只能特異性識別

          一種外泌體表面Marker蛋白質(zhì)，而本試劑盒是特異性識別膜脂質(zhì)成分，更能廣泛獲得外泌體。有事例表明識

          別表面Marker蛋白質(zhì)抗體不能識別不同動物物種的抗原，而本試劑盒能在大范圍的動物物種中運(yùn)用（人，

          小鼠，牛等都有報道）。

 

Q11　與其他方法相比回收的純度如何？

A11　與傳統(tǒng)沉淀法（超速離心法、多聚物沉淀法）相比，純度更高。與超速離心法和密度梯度離心法相結(jié)合的方

          法相比，能簡便地獲得同等高純度的外泌體。（原因：采用抗體的傳統(tǒng)親和法是用變性劑進(jìn)行洗脫，因此很

          容易混入粒子等非特異性吸附物。然而此款試劑盒是用螯合劑來洗脫的，所以難以混入非特異性吸附物。）

 

Q12　與其他方法相比回收率如何？

A12　與采用抗體的傳統(tǒng)親和法、超速離心法相比，能獲得更高的回收率（低于聚合物沉淀法）。

 

?　關(guān)于試劑盒的操作方法、組成

Q13　操作該試劑盒耗時多久？

A13?。?個小時預(yù)處理樣品），該試劑盒Exosome Capture磁珠的固定需要15分鐘，然后3個小時的化學(xué)反應(yīng)，

           最后15分鐘洗脫，總計3小時30分鐘。

 

Q14　本試劑盒需要特別慎重的操作嗎？

A14　Exosome Capture固定化磁珠與樣品反應(yīng)后的清洗步驟中最后需要去除洗凈液。完全去除后再進(jìn)行提取。

          提取時在提取液中加入磁珠后，確保磁珠不發(fā)生凝集并處于懸浮狀態(tài)。

 

Q15　提取液的組成有哪些？

A15　是含有1mM的螯合劑、鹽、防腐劑的Tris基礎(chǔ)溶液。若以上成分阻礙后續(xù)分析，請使用超速離心膜

         （Sartorius公司  VivaSpin500，使用100K分子量截留，Code：VS0141）并替換合適的Buffer。

 

Q16　Exosome Capture 固定后磁珠可以循環(huán)利用嗎？

A16　可以。為了能夠高效回收樣品中的外泌體，試劑盒可完成5次回收實(shí)驗(yàn)。試劑盒里的緩沖液只含5次純化的

          量。1mL體積以上樣本建議進(jìn)行濃縮后再回收，純化時可進(jìn)行反復(fù)抽提，提高純化效率。詳情參考操作說

          明書。

 

Q17　Exosome Capture固定化磁珠能保存嗎？

A17　可以。洗脫出外泌體后的磁珠需再使用，用試劑盒附帶的 Washing buffer或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18　實(shí)驗(yàn)要留到第二天需要做什么步驟？

A18　Exosome Capture固定化磁珠與樣品的反應(yīng)步驟（反應(yīng)時間3小時）可以過夜（置于4℃下）。

 

?　關(guān)于樣品用量

Q19　樣品純化所需的最低量是？

A19　使用旋轉(zhuǎn)器的需要500μL以上，使用離心管混合器的需要100μL。樣品量更少的情況下加TBS到所需最低量后

          再使用Exosome Capture固定化磁珠。

 

Q20　大量的樣品能回收嗎？

A20　可濃縮后再回收。如果樣品是培養(yǎng)上清，可以從體積50毫升的樣品中回收外泌體。離心分離預(yù)處理后，取

          50mL上清液超離濃縮至1mL（推薦Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code：VS2041）。無

          血清培養(yǎng)基和添加了10% FBS的培養(yǎng)基也可以收集外泌體。詳情參照操作說明書。因?yàn)檠鍢悠窡o法濃縮，

          最多只能用10ｍL的樣品。但是大于1mL的血清回收率低，建議反復(fù)提純。

 

?　關(guān)于外泌體提取后的分析

Q21　外泌體中含有什么？

A21　含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。

 

Q22　提取后的細(xì)胞外囊泡可以用什么方法檢測？

A22　因?yàn)槟艿玫酵暾募?xì)胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。

         （例）蛋白質(zhì)分析：蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡、質(zhì)譜分析、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等

      核酸分析如：定量PCR、微陣列（生物芯片）、新一代測序等

      粒子分析：電鏡分析，納米位點(diǎn)分析（NTA）等

      功能分析：體內(nèi)外的用藥實(shí)驗(yàn)等

 

Q23　提取后的細(xì)胞外囊泡（EVs）能直接添加到細(xì)胞使用中嗎？

A23　可以使用，但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影響，參考Q15替換合適的Buffer。使用離心過濾

          部件。

         （Millipore公司ΜLtrafree – MC， GV 0.22μm 已滅菌、Code：UFC30GV0S）除菌。

 

Q24　電鏡分析需要外泌體的量是多少？

A24　能用電鏡觀察到2-4×10¹⁰的粒子（通過納米技術(shù)檢測）。

 

Q25　提取出的細(xì)胞外囊泡的保存條件是？

A25　冷藏、冷凍保存。長期保存需要放到-80℃。

          為避免凍結(jié)溶解，凍結(jié)保存推薦細(xì)分后保存。

 

Q26　如何做回收的外泌體提取液的免疫印跡？

A26　本公司研究所從回收的100 μL提取液抽取15 μL，加入5 μL 4×SDS樣品Buffer，共20μL的樣品全量上樣進(jìn)行

          SDS-PAGE。用量與宣傳冊上的免疫印跡的樣本量一致。

Q27　Exosome質(zhì)譜檢測的步驟是？

A27　外泌體提取→SDS-PAGE與膠內(nèi)酶切→通過LC-MC/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析

 

?　關(guān)于外泌體標(biāo)記

Q28　用該試劑盒提取出來的囊泡怎么判斷是外泌體呢？

A28　根據(jù)表面抗原的抗體（WB）、電子顯微鏡、密度梯度離心、納米粒度測量（如NanoSight LM10）等來

          驗(yàn)證。

Q29　外泌體分離后用免疫印跡法確認(rèn)的標(biāo)記蛋白是什么？

A29　CD9， CD63， CD81， Frotillin-2， Lamp-1等。

 

?　相關(guān)產(chǎn)品

Q30　有在銷售和光檢測外泌體用的抗體嗎？

A30　本公司當(dāng)前銷售以下抗體。

          Anti CD9 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL）

          Anti CD81 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.012-27063）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.016-27061）

 

Q31　有可以從分離囊泡里提純RNA的試劑盒嗎？

A31　有。可使用microRNA Extractor SP Kit（295-71701）比AGPC法更能高效提純RNA。

 

Q32　有銷售磁支架嗎？

A32　有的。Wako品牌，產(chǎn)品編號290-35591，MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架?！?/span>

 

Q33　該技術(shù)專利是什么？

A33　已申請PCT專利。

Q34　加入什么金屬離子？

A34　鈣離子

 

Q35　血漿提取方法是？

A35　請查看相關(guān)資料。

Q36　試劑盒中的22支反應(yīng)管有什么特殊之處嗎？用普通的1.5mL離心管可以嗎？

A36　該試劑盒中的反應(yīng)管使用特殊材質(zhì)，可減少磁珠吸附，該反應(yīng)管可單賣

A36　BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。

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