Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)

長(zhǎng)單鏈DNA（ssDNA）制備試劑盒

　　本產(chǎn)品使用Nicking切口酶法（正在申請(qǐng)專(zhuān)利的新技術(shù)），是制備高純度且有正確序列的長(zhǎng)單鏈DNA（ssDNA, 1500 base或3000 base）的試劑盒。

　　※本產(chǎn)品不含凝回收試劑盒。
　　※本產(chǎn)品用于研究，不可用于臨床實(shí)驗(yàn)。

◆關(guān)于ssDNA的制備

　　ssDNA運(yùn)用廣泛，但由于制備是有PCR和使用合成DNA的寡聚體，核酸外切酶反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)等工序，無(wú)法避免內(nèi)部突變和末端缺失等問(wèn)題的發(fā)生。雖然純化使用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳以及鏈霉親和素包被的磁珠等方法，但還是會(huì)出現(xiàn)混入大量dsDNA的情況。
　　Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)，通過(guò)簡(jiǎn)單的操作，便可獲得含有目的序列的高純度長(zhǎng)鏈ssDNA。

◆特點(diǎn)

　●　不含有變異或末端缺失，可制備1,500 base或者最長(zhǎng)到3,000 base的長(zhǎng)鏈ssDNA。

　●　全程操作與普通的dsDNA片段制備法相同，無(wú)需準(zhǔn)備特殊的機(jī)器以及試劑。

　●　通過(guò)附加的Denaturing Gel-loading Buffer（變性凝膠上樣緩沖液）進(jìn)行變性，可以使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的長(zhǎng)鏈ssDNA進(jìn)行分離純化。

　●　凝膠電泳配有已染色的RNA作為分子量標(biāo)記。

◆試劑盒的內(nèi)容

●	Plasmid
●	Denaturing gel-loading buffer
●	Prestain marker for RNA highDynaMarker?

◆質(zhì)粒圖譜

◆原理和操作方法

1.	對(duì)附加了目的DNA片段的質(zhì)粒的MCS（多克隆位點(diǎn)）中兩個(gè)切口酶位點(diǎn)之間或者是切口酶位點(diǎn)與限制酶位點(diǎn)之間進(jìn)行克隆。
2.	對(duì)克隆位點(diǎn)使用相應(yīng)的切口酶和限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒。
3.	消化后的質(zhì)粒通過(guò)附加的Denaturing Gel-loading Buffer（變性凝膠上樣緩沖液）進(jìn)行變性，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
4.	切出跑在前端的帶，純化后得到目的ssDNA。

◆使用例

　　使用Long ssDNA Preparation Kit (LsODN Preparation Kit)制備的1,500 base和3,000 base的長(zhǎng)鏈ssDNA。

　　將目的dsDNA片段(1,500 bp或者3,000 bp)在pLSODN -1或pLSODN-3的MCS（Nt.BspQI位點(diǎn)與Nb.BsrDI位點(diǎn)之間）克隆后，使用切口酶（Nt.BspQI和Nb.BsrDI）對(duì)其處理，在目的片段的兩端出現(xiàn)切口。變性后，樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，從目的條帶提取DNA，純化。將所有的樣品通過(guò)變性凝膠上樣緩沖液進(jìn)行變性后，再進(jìn)行電泳。

　　Lane 1：已導(dǎo)入1,500 bp DNA片段的pLSODN-1通過(guò)切口酶處理后的樣品
　　Lane 2：已純化的長(zhǎng)鏈ssDNA (1,500 base)
　　Lane 3：已導(dǎo)入3,000 bp DNA片段的pLSODN-1通過(guò)切口酶處理后的樣品
　　Lane 4:：已純化的長(zhǎng)鏈ssDNA (3,000 base)

相關(guān)資料

 

說(shuō)明書(shū)

相關(guān)產(chǎn)品

 

生產(chǎn)商	產(chǎn)品編號(hào)	商品名	規(guī)格
BDL	DM260	DynaMarker, Prestain Marker for   RNA High	180μl
BDL	DM122	DynaMarker, DNA High D	1set

 

◆Funa凝膠槍和切片凝膠專(zhuān)用吸管

　　通過(guò)簡(jiǎn)單操作能將瓊脂糖凝膠電泳后的DNA和蛋白質(zhì)帶部分回收的槍頭以及專(zhuān)用短移液器。

詳情請(qǐng)看下圖：

長(zhǎng)單鏈DNA（ssDNA）制備試劑盒的使用文獻(xiàn)

　　ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes
　　Yoshimi K, Kunihiro Y, Kaneko T, Nagahora H, Voigt B, Mashimo T. Nature Communicatons.Jan;20;7:10431 (2016).

　　使用切口酶法（本產(chǎn)品）制備的長(zhǎng)鏈ssDNA（包含了2Apeptide序列，GFP全域序列，5'端300個(gè)堿基同源臂，3'端60個(gè)堿基同源臂，全長(zhǎng)1,194 base的互補(bǔ)單鏈DNA）以及附加了poly（A）的Cas9-poly(A)RNA，向?qū)NA：向大鼠受精卵顯微注射Thy1-TGA，在大鼠rThy1基因C末端處高效率地將綠色熒光蛋白基因（GFP基因）全域成功敲入。本論文也是首次表明，使用長(zhǎng)鏈ssDNA的lsODN法（對(duì)應(yīng)ssODN的lsODN）能夠提高外源基因全長(zhǎng)的敲除效率。