MagCapture™ microRNA分離試劑盒系列

　　本公司提供可實現(xiàn)從Ago免疫沉淀到RNA純化一系列更簡便操作的「microRNA Isolation Kit」系列產(chǎn)品。通過使用該系列產(chǎn)品，可便利地從人或小鼠的細胞、組織中回收Ago蛋白質(zhì)結(jié)合microRNA以及目標mRNA。另外，從培養(yǎng)上清、血清、血漿中也可回收游離狀態(tài)的Ago蛋白質(zhì)結(jié)合microRNA?；厥蘸蟮腞NA可用于定量PCR、微陣列芯片（Microarray）、新一代序列分析等各種應(yīng)用。該系列產(chǎn)品擴充至有采用了磁珠的MagCapture™ microRNA Isolation Kit和采用硅珠的，共8種試劑盒。

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠型）

　　該系列有抗人Ago2抗體（4G8）、抗鼠Ago2抗體（2D4）、抗Ago1-4抗體（1G3）包被磁珠的三種試劑盒以及含有可固定任意抗體的Protein G磁珠試劑盒，共計4款產(chǎn)品。這些試劑盒都采用磁珠，可更方便地進行重復(fù)性良好的免疫沉淀操作。在免疫沉淀后的純化RNA步驟中，采用能獲得高純度RNA的離心柱法；此外，也可以采用含有抗Ago抗體包被磁珠的3種試劑盒的更簡便的一步法。

試劑盒內(nèi)容（例：Human Ago2, 10次用）

●　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution——600μL×1支

●　Cell Lysis Solution——20mL×1支

●　Washing Solution for IP——40mL×1支

●　Elution Solution I for IP—— 500μL×1支

●　Elution Solution II for IP——500μL×1支

●　Binding Solution for Spin Column——2mL×1支

●　Binding Enhancer for Spin Column——100μL×1支

●　Washing Solution I for Spin Column——3mL×1支

●　Washing Solution II for Spin Column—— 4mL×1支

●　Elution Solution for Spin Column——1mL×1支

●　Spin Column/Collection Tube——10支

◆概述圖

 

產(chǎn)品名稱	使用抗體克隆號	適應(yīng)物種	對應(yīng)樣本	回收RNA	IP B/F 分離	RNA提純
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human   Ago2	4G8	人、猴、狗	細胞/ 組織/血清/ 血漿	microRNA 和目標mRNA	磁力分離	離心柱法、一步法
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse   Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago   1-4	1G3	人、猴、狗,   小鼠、大鼠		microRNA
MagCapture™ microRNA Isolation Kit,   Protein G	隨意	參照抗體	細胞/組織	參照抗體		離心柱法

 

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 實驗案例（人）

從人細胞系中回收microRNA

　　用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法（銀染色）確認通過本產(chǎn)品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2）從人K562細胞（1×10⁷ cells）中獲得的microRNA（圖1）。結(jié)果表明，使用本產(chǎn)品可獲得高純度的microRNA。此外，通過定量PCR法（miR-92a量），與使用原產(chǎn)品microRNA Isolation Kit, Human Ago2所獲得的microRNA量相比較可知（圖2），本產(chǎn)品的離心柱法顯示與原產(chǎn)品幾乎一樣的microRNA回收性能；另外，在一步法中顯示出了比原產(chǎn)品更優(yōu)秀的microRNA回收性能。

 

圖1.銀染色檢測從人K562細胞純化的microRNA	圖2.人K562細胞中純化microRNA回收量的比較
LaneM：標記 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）

 

從人血漿中回收結(jié)合游離Ago蛋白質(zhì)的microRNA

　　通過定量PCR法比較使用本產(chǎn)品和原產(chǎn)品從200μL正常人混合血漿中獲取的microRNA量。結(jié)果顯示，本產(chǎn)品的離心柱法與原產(chǎn)品具有幾乎一樣的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原產(chǎn)品多。（見圖３）

圖３．人血漿中純化microRNA回收量的比較

microRNA的目標mRNA回收

　　向miR-122低表達的肝癌細胞株HepG2細胞（5×10⁵ cells）中導入人工合成的miR-122和調(diào)節(jié)用熒光素酶siRNA（Luc siRNA），使用本產(chǎn)品和原產(chǎn)品獲得配制的Ago2 IP RNA以及用ISOGEN^?  配制的total RNA。通過定量PCR法比較各RNA種所含miR-122的量（圖4）和其目標mRNA（目標基因中Aldo A mRNA的量用GAPDH mRNA的量補充）。（圖5）。結(jié)果表明，與原產(chǎn)品一樣，通過本產(chǎn)品獲得的目標mRNA中，Aldo A mRNA和miR-122一同被濃縮，由此可知使用本產(chǎn)品可以獲得microRNA的目標mRNA。另一方面，使用ISOGEN^? 獲得的total RNA中，Aldo A mRNA隨著miR-122的增加而逐漸分解減少。

圖4.miR-122回收量的比較

圖5.目標mRNA回收量的比較

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 實驗案例（小鼠）

從小鼠細胞中回收microRNA

　　用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（銀染色）確認通過使用本產(chǎn)品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）從小鼠P388D1細胞（2×10⁷ cells）中獲得的microRNA。（圖1）結(jié)果表明，使用本產(chǎn)品可獲得高純度的microRNA。此外，通過定量PCR法（miR-92a量），與使用原產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）所獲得的microRNA量相比較可知（圖2），本產(chǎn)品的離心柱法顯示與原產(chǎn)品幾乎一樣的microRNA回收性能；另外，在一步法中顯示出了比原產(chǎn)品更優(yōu)秀的microRNA回收性能。

 

圖1．銀染色檢測從小鼠P388D1細胞純化的microRNA LaneM：標記 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）	圖2．小鼠P388D1細胞純化microRNA回收量的比較

從大鼠血漿中回收游離Ago2蛋白質(zhì)結(jié)合microRNA

　　通過定量PCR法（miR-92a量）比較使用本產(chǎn)品和原產(chǎn)品從200μL大鼠血漿中獲取的microRNA量。結(jié)果表明，本產(chǎn)品的離心柱法與原產(chǎn)品具有幾乎一樣的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原產(chǎn)品大。（圖3）

圖3.人血漿中純化microRNA回收量的比較

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1-4 實驗案例（人）

回收Ago1-4結(jié)合microRNA

　　分別使用Ago1, Ago2, Ago3, Ago4特異性抗體對HeLa細胞中各RNA片段免疫沉淀處理后，進行微陣列芯片（3D-Gene^? ，東麗）分析。結(jié)果表明miR-22和miR-16多數(shù)被Ago2抗體吸收。另一方面，miR-1260b, miR-4286多數(shù)被Ago1, Ago3, Ago4吸收。（表1）

　　基于此解析結(jié)果，驗證使用本產(chǎn)品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4），是否可回收原產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）中被Ago1, Ago3, Ago4吸收較為困難的microRNA。

 

                                                             表1. 微陣列芯片分析結(jié)果

	信號強度				信號比
Name	Ago1   IP	Ago2   IP	Ago3   IP	Ago4   IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.20
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.30	0.10	0.43

 

圖1.從HeLa細胞中回收的各microRNA量的比較

 

從人和小鼠細胞株中回收microRNA

　　通過定量PCR法（miR-92a量）比較使用本產(chǎn)品和原產(chǎn)品從人K562細胞（1×10⁷ cells）和小鼠P388D1細胞（2×10⁷ cells）中獲取的microRNA量。結(jié)果表明，在同等條件下，使用本產(chǎn)品可獲得更多的microRNA。（圖2、圖3）

 圖2.人K562細胞中純化microRNA回收量的比較                   圖3.小鼠P388D1細胞中純化microRNA回收量的比較

 

從人和大鼠血漿中回收游離Ago結(jié)合microRNA

　　通過定量PCR法（miR-92a量）比較使用本產(chǎn)品和原產(chǎn)品（microRNAIsolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）從人和大鼠血漿中中獲取的microRNA量。結(jié)果表明，在同等條件下，使用本產(chǎn)品可獲得更多的microRNA。（圖4、圖5）

     圖4.人血漿中純化microRNA回收量的比較　　　　　　            圖5.大鼠血漿中純化microRNA回收量的比較

 

從各種動物細胞株中回收microRNA

　　通過定量PCR法（miR-92a量）測量使用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4從2×10⁶ cells的K562細胞（人）、COS-7細胞（猴）、MDCK細胞（狗）、P388D1細胞（小鼠）、SCC-131細胞（大鼠）中獲取的免疫沉淀RNA片段中microRNA量和使用ISOGEN^?  從各種細胞中獲取的total RNA片段中microRNA量。比較各免疫沉淀RNA片段中所含miR-92a 量和totalRNA片段中所含miR-92a量的相對值可知，本產(chǎn)品可在全部的細胞種類中獲取microRNA。（圖6）

圖6.從各種細胞中獲取的microRNA量的比較

 

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G 實驗案例

從人和小鼠細胞株中回收microRNA（與原產(chǎn)品的比較）

　　通過定量PCR法（miR-92a量）比較在使用本產(chǎn)品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, ProteinG）和抗Ago1抗體（2A7）、抗人Ago2抗體（4G8）、抗人Ago3抗體（1C12）從人K562細胞（1×10⁷ cells）中獲得的microRNA量以及使用原產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）獲得的microRNA量（圖1,2,3）。此外，通過定量PCR法（miR-92a量）比較在使用本產(chǎn)品和抗小鼠Ago2抗體（2D4）從小鼠P388D1細胞（2×10⁷ cells）中獲得的microRNA量以及使用原產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）獲得的microRNA量（圖4）。結(jié)果表明，本產(chǎn)品和任意抗Ago抗體組合使用，獲得的microRNA量要比原產(chǎn)品多。

從人和小鼠細胞株中回收各種Ago蛋白質(zhì)結(jié)合microRNA

　　通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本產(chǎn)品和抗Ago1抗體（2A7）、抗人Ago3抗體（1C12）、抗Ago4抗體（2G7)從人K562細胞（1×10⁷cells）中獲得的microRNA量（圖5）。此外，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本產(chǎn)品和抗Ago1抗體（2A7）、抗小鼠Ago2抗體（2D4）、抗小鼠Ago3抗體（S09）、抗Ago4抗體（2G7)從小鼠P388D1細胞中獲得的microRNA量（圖6）。結(jié)果表明，本產(chǎn)品和任意抗Ago抗體組合使用，可獲得各種Ago蛋白結(jié)合microRNA。

 

圖1.抗Ago3抗體固定時microRNA回收量的比較 本產(chǎn)品：使用抗Ago1抗體（2A7） 原產(chǎn)品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago1 （291-70201）	圖2.人Ago2抗體固定時microRNA回收量的比較 本產(chǎn)品：使用抗人Ago2抗體（4G8） 原產(chǎn)品：microRNA Isolation Kit, Human Ago2 （292-66701）
圖3.人Ago3抗體固定時microRNA回收量的比較 本產(chǎn)品：使用抗人Ago3抗體（1C12） 原產(chǎn)品：microRNA Isolation Kit, Human Ago3 （297-70301）	圖4.小鼠Ago2抗體固定時microRNA回收量的比較 本產(chǎn)品：使用抗小鼠Ago2抗體（2D4） 原產(chǎn)品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago2 （292-67301）

 

圖5.從人K562細胞中純化的microRNA回收量的比較和銀染色檢驗

圖6.從小鼠P388D1細胞中純化的microRNA回收量的比較和銀染色檢驗