磁珠型microRNA分離試劑盒

FUJIFILM Wako提供能使從Ago 免疫沉淀到RNA 提取等一系列實驗操作簡化的“microRNA Isolation Kit”系列。使用本系列試劑盒能簡便地從人和小鼠的細(xì)胞或組織中提取Ago蛋白結(jié)合的microRNA以及靶mRNA，還能從培養(yǎng)上清、血清、血漿中提取游離Ago蛋白結(jié)合的microRNA。所提取到的RNA可以應(yīng)用于qPCR、微陣列檢測、NGS等下游實驗。本系列包括采用磁珠的MagCapture™ microRNA Isolation Kit，以及采用了硅膠珠法的microRNA Isolation Kit。

MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠法）系列產(chǎn)品包括含抗人Ago2抗體（4G8）、抗小鼠Ago2抗體（2D4）、抗Ago1-4抗體（1G3）固相化磁珠這三種試劑盒，以及第四種——能結(jié)合任意抗體的Protein G磁珠。上述試劑盒全部采用磁珠法，可進(jìn)行簡易的免疫沉淀操作并獲得良好的重復(fù)性。免疫沉淀后提取的RNA可進(jìn)一步使用離心柱純化，獲得高純度的RNA；若使用含有抗Ago抗體固定化磁珠的3種試劑盒，也可使用一步法更加簡便地提取RNA（備注：RNA與磁珠不分離）。

◆試劑盒組成（例：Human Ago2, 10次用）

  1.　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution：600 μL×1瓶

  2.　Cell Lysis Solution：20 mL×1瓶

  3.　Washing Solution for IP：40 mL×1瓶

  4.　Elution Solution I for IP：500 μL×1瓶

  5.　Elution Solution II for IP：500 μL×1瓶

  6.　Binding Solution for Spin Column：2 mL×1瓶

  7.　Binding Enhancer for Spin Column：100 μL×1瓶

  8.　Washing Solution I for Spin Column：3 mL×1瓶

  9.　Washing Solution II for Spin Column：4 mL×1瓶

10.　Elution Solution for Spin Column：1 mL×1瓶

11.　Spin Column/Collection Tube：10瓶

◆操作示意圖

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2 使用例子（人）

提取人細(xì)胞株中的microRNA

通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（銀染），檢測使用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2）從人K562細(xì)胞（1×10⁷ cells）中提取的microRNA（圖1）。結(jié)果顯示，本系列試劑盒可提取得到高純度的microRNA。通過qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較使用本品和硅膠珠型產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit，Human Ago2）提取的microRNA量（圖2）。本系列試劑盒的離心柱法具有幾乎與硅膠珠法相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取能力比硅膠珠法更好。

圖1.　對從人K562細(xì)胞中提取的microRNA的進(jìn)行銀染檢測

圖2.　比較從人K562細(xì)胞中提取的microRNA量

提取人血漿中的游離Ago2蛋白結(jié)合microRNA

以qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較使用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅膠珠型產(chǎn)品從200μL健康人混合血漿中提取的microRNA量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試劑盒中的離心柱法具有幾乎與硅膠珠型產(chǎn)品相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取量比硅膠珠型高（圖3）。

圖3.　比較從人血漿中提取的microRNA量

提取microRNA的靶標(biāo)mRNA

向miR-122低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞（5×10⁵ cells）導(dǎo)入人工合成的miR-122或調(diào)控的熒光素酶siRNA（Luc siRNA），提取了分別用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅膠珠型產(chǎn)品制備的Ago2 IP RNA，以及用ISOGEN^? 制備的total RNA。運用qPCR法比較各種RNA中含有的miR-122量（圖4）與其靶標(biāo)mRNA（Aldo A mRNA是miR-122靶標(biāo)之一，以GAPDH內(nèi)參作校正）量（圖5）。與硅膠珠型產(chǎn)品一樣，本品提取的RNA中富集了miR-122和Aldo A mRNA，因此，可以利用本品提取microRNA的靶標(biāo)mRNA。另一方面，用ISOGEN^? 制備的total RNA中的Aldo A mRNA會隨著miR-122的增加而分解并減少。

圖4.　miR-122提取量的比較

圖5.　靶標(biāo)mRNA提取量的比較

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 使用例子（小鼠）

從小鼠細(xì)胞株中提取microRNA

通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（銀染），檢測用本試劑盒（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）從小鼠P388D1細(xì)胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA（圖1）。結(jié)果顯示，本品能提取出高純度的microRNA。另外，以qPCR法對miR-92a進(jìn)行定量，比較使用硅膠珠型產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）提取到的microRNA量（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本品的離心柱法具有與硅膠珠型產(chǎn)品幾乎同樣的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅膠珠型產(chǎn)品更好。

圖1.　對從小鼠P388D1細(xì)胞中提取的microRNA的進(jìn)行銀染檢測

圖2.　比較從小鼠P388D1細(xì)胞中提取的microRNA量

從大鼠血漿中提取游離Ago2蛋白結(jié)合microRNA

通過qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較使用本品以及硅膠珠型產(chǎn)品從200μL大鼠血漿中提取到的microRNA量。本品的離心柱法具有與硅膠珠型產(chǎn)品幾乎同樣的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅膠珠型產(chǎn)品更好（圖3）。

圖3.　比較從大鼠血漿中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1–4 使用例子（人）

提取Ago1–4結(jié)合microRNA

用各種Ago1、Ago2、Ago3、Ago4特異性抗體進(jìn)行微陣列檢測分析免疫沉淀后HeLa中的各個RNA組分，結(jié)果顯示，Ago2中捕獲了大量miR-22和miR-16，而Ago1、Ago3、Ago4中則捕獲了大量的miR-1260b和miR-4286（表1）。

	信號強(qiáng)度				信號比
名稱	Ago1 IP	Ago2 IP	Ago3 IP	Ago4 IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.2
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.3	0.1	0.43

表1.　微陣列檢測分析結(jié)果

上述分析結(jié)果驗證了我們可以利用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4，從Ago1、Ago3、Ago4中提取硅膠珠型產(chǎn)品難以提取的大量microRNA。

使用本品和硅膠珠型產(chǎn)品，提取HeLa細(xì)胞（1×10⁷ cells）中的microRNA，以miR-92a作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，通過qPCR檢測miR-22、miR-1、miR-1260b、miR-4286的提取量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ago1、Ago3、Ago4中miR-1260b、miR-4286的提取量比硅膠珠型產(chǎn)品更高（圖1）。因此，本品不僅能提取Ago2中的microRNA，還能從Ago1、Ago3、Ago4中提取硅膠珠型產(chǎn)品難以提取的大量microRNA。

圖1.　比較從HeLa細(xì)胞中提取的各種microRNA量

提取人和小鼠細(xì)胞株中的microRNA

以qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較用本品和硅膠珠型產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）從人K562細(xì)胞（1×10⁷ cells）及小鼠P388D1細(xì)胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量。結(jié)果顯示，本品可提取和硅膠珠型產(chǎn)品相同甚至更多的microRNA（圖2，3）。

圖2.　比較從人K562細(xì)胞中提取的microRNA量

圖3.　比較從小鼠P388D1細(xì)胞中提取的microRNA量

提取人和大鼠血漿中的游離Ago結(jié)合microRNA

以qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較用本品和第一代產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）從200μL人以及大鼠血漿中提取的microRNA量。結(jié)果顯示，本品可提取和硅膠珠型產(chǎn)品相同甚至更多的microRNA（圖4,5）。

圖4.　比較從人血漿中提取的microRNA量

圖5.　比較從大鼠血漿中提取的microRNA量

提取各種動物細(xì)胞株中的microRNA

以qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，檢測用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4從2×10⁶ cells的K562細(xì)胞（人）、COS-7細(xì)胞（猴）、MDCK細(xì)胞（狗）、P388D1細(xì)胞（小鼠）、SCC-131細(xì)胞（大鼠）中提取的免疫沉淀組分中的microRNA量，和用ISOGEN^? 從各種細(xì)胞中提取的total RNA組分中的microRNA量。通過比較各種免疫沉淀所得到的RNA組分中的miR-92a量和total RNA組分中的miR-92a量的相對值，表明本品適合提取上述全部細(xì)胞中的microRNA（圖6）。

圖6.　比較從各種動物細(xì)胞中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G使用例子

提取人和小鼠細(xì)胞株中的microRNA（與硅膠珠型產(chǎn)品的比較）

以qPCR法對miR-92a進(jìn)行定量，比較用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G）和抗Ago1抗體（2A7）、抗人Ago2抗體（4G8）、抗人Ago3抗體（1C12）從人K562細(xì)胞（1×10⁷ cells）提取的microRNA量，和用硅膠珠型產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）提取的micro RNA量（圖1,2,3,）。另外，以qPCR對miR-92a進(jìn)行定量，比較用本品和抗小鼠Ago2抗體（2D4）從小鼠P388D1細(xì)胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量，和用硅膠珠型產(chǎn)品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）提取的microRNA量（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本品與任意抗Ago抗體結(jié)合使用，能比硅膠珠型產(chǎn)品提取到更多的microRNA。

圖1.　比較結(jié)合了抗Ago1抗體時的microRNA提取量

圖2.　比較固定抗人Ago2抗體時的microRNA提取量

圖3.　比較固定抗人Ago3抗體時的microRNA提取量

圖4.　比較固定抗小鼠Ago2抗體時microRNA的提取量

提取人與小鼠細(xì)胞株中各種Ago蛋白結(jié)合microRNA

通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和qPCR，對用本品和抗Ago1抗體（2A7）、抗人Ago2抗體（4G8）、抗人Ago3抗體（1C12）、抗Ago4抗體（2G7)從人K562細(xì)胞（1×10⁷ cells）中提取的miR-92a表達(dá)量進(jìn)行檢測（圖5）。另外，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和qPCR（miR-92a量），檢測用本品和抗Ago1抗體（2A7）、抗小鼠Ago2抗體（2D4）、抗小鼠Ago3抗體（S09）、抗Ago4抗體（2G7)從小鼠P388D1細(xì)胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量（圖6）。結(jié)果表明，本品與任意的抗Ago抗體組合使用，能提取與各種Ago結(jié)合的microRNA。

圖5.　從人K562細(xì)胞中提取的microRNA量的比較與銀染檢測

圖6.　從小鼠P388D1細(xì)胞中提取的microRNA量的比較與銀染檢測

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	使用 抗體 克隆號	對應(yīng) 物種	對應(yīng)樣本	提取RNA	IP   B/F 分離法	RNA 提取法
295-74001	MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 MagCapture™ microRNA 分離試劑盒，人Ago2	4G8	人、猴、狗	細(xì)胞/ 組織 血清/ 血漿	microRNA 靶標(biāo)mRNA	磁力 分離	離心 柱法 一步法
297-74201	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2 MagCapture™ microRNA 分離試劑盒，小鼠Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
293-74801	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Ago 1-4 MagCapture™ microRNA 分離試劑盒，Ago1-4	1G3	人、猴、狗、小鼠、大鼠		microRNA
299-74401	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Protein G MagCapture™ microRNA 分離試劑盒，蛋白G	隨意 選擇	根據(jù)使用的抗體而定	細(xì)胞/ 組織	根據(jù)使用的抗體而定		一步法