DsDD cDNA Subtraction Kit (和光新推)

雙鏈特異性直接消化cDNA削減試劑盒

　　無(wú)需斷片即可削減Tester cDNA。

　　DsDD(Duplex-specific Direct Digestion) cDNA Subtraction Kit Wako是從cDNA庫(kù)通過(guò)削減法配制Tester和Driver cDNA。利用Tester和cDNA混合形成組織非特異性表達(dá)的基因，再通過(guò)雙鏈特異性DNA核酸酶-Duplex-specific nuclease分解雜交cDNA。分解后，用ExonucleaseⅠ分解去除殘留Driver cDNA，從而實(shí)現(xiàn)在Tester cDNA中高效濃縮特異性表達(dá)的cDNA。

　　本品用作解析癌細(xì)胞組織特異性功能和性質(zhì)時(shí)，Tester cDNA從癌細(xì)胞組織、而Driver cDNA從正常細(xì)胞中提取，可濃縮來(lái)自癌細(xì)胞組織特異性表達(dá)的基因的cDNA 。DsDD cDNA Subtraction Kit 中的cDNA庫(kù) 可作為起始材料，全部工序完成僅需2天，是劃時(shí)代的技術(shù)。

◆特點(diǎn)

●　可從cDNA庫(kù)制作

●　Tester和Driver的優(yōu)異選擇性

●　采用Duplex-specific nuclease去除法

●　操作簡(jiǎn)單，作業(yè)工序僅需2天

◆試劑盒原理

準(zhǔn)備Tester cDNA庫(kù)和Driver cDNA庫(kù)。在Tester cDNA庫(kù)中，cDNA插入方向要與載體一致。 １．?dāng)U增Tester cDNA 擴(kuò)增DNA中在5’端添加磷酸引物使用。 ２． λ 核酸外切酶處理 識(shí)別雙鏈DNA 5’端磷酸化引物并從5’到3’開(kāi)始降解。Tester沒(méi)有雜交，削減效率加強(qiáng)。 ３．限制性?xún)?nèi)切酶處理 消化兩端的接頭保證準(zhǔn)確的雜交結(jié)果。 ４．雜交 Tester cDNA和Driver cDNA在68℃中反應(yīng)16-20小時(shí)（混合比率=1:200）。過(guò)量的Driver cDNA使大部分Tester cDNA形成單鏈DNA。 ５．雙鏈特異性核酸酶處理 酶特異性酶切單鏈DNA。高反應(yīng)溫度（68℃）保證反應(yīng)的特異性。 ６．核酸外切酶 I處理 酶特異性酶切單鏈DNA。非特異性基因?yàn)閱捂?，然后被降解。反?yīng)后，Tester能特異性表達(dá)基因的單鏈DNA能保留。 此高效cDNA削減方法完成僅需2天。

◆使用案例

　　利用人肝癌來(lái)源的HepG2細(xì)胞和人正常肝臟來(lái)源的cDNA庫(kù)，對(duì)高表達(dá)管家基因-GAPDH和HepG2細(xì)胞中特異性表達(dá)的AFP基因進(jìn)行削減。

 

　　在HepG2 cDNA和正常肝臟cDNA都能檢測(cè)出GAPDH的條帶，但Subtraction cDNA沒(méi)有檢測(cè)出條帶。另外，正常肝臟組織cDNA沒(méi)有檢測(cè)出AFP條帶，但在Subtraction cDNA中能檢測(cè)到與HepF2 cDNA同等亮度的AFP條帶。通過(guò)本方法得到的Subtraction cDNA能高效濃縮HepG2的特異性表達(dá)基因。

Q&A

Ｑ： 　DsDD cDNA Subtraction Kit做什么的試劑盒？

Ａ：　將需要做比較的cDNA庫(kù)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增制備Tester和Driver cDNA，對(duì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行削減的試劑盒。與傳統(tǒng)方法相比，操作更簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)時(shí)間也僅需2天時(shí)間?？梢詫F(xiàn)有的cDNA庫(kù)或市面售賣(mài)的cDNA庫(kù)直接開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這是傳統(tǒng)方法所不能做到的。而且最終制備出來(lái)的Subtraction cDNA是混入管家基因較少的cDNA，可以直接應(yīng)用于各種用途。

Ｑ： 　DsDD cDNA Subtraction Kit有什么優(yōu)點(diǎn)？

Ａ：●　直接使用現(xiàn)有的cDNA，全部工序完成僅需2天。

Ａ：●　全程在DNA狀態(tài)下進(jìn)行，無(wú)需熟練的操作技術(shù)。cDNA的制備有非常高的選擇性。

Ａ：●　可以通過(guò)市面或用戶自己準(zhǔn)備的質(zhì)粒cDNA來(lái)制備。

Ａ：●　除了質(zhì)粒以外，還可以從5’和3’端帶接頭的cDNA制備cDNA。

Ａ：●　操作簡(jiǎn)便

Ａ：●　最終制備出來(lái)的Subtraction cDNA反映最初所用的Tester cDNA。因?yàn)門(mén)ester沒(méi)有經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶處理，所以一開(kāi)始的Tester cDNA可以反映最終制備的Subtraction cDNA的狀態(tài)。原理上，在載體庫(kù)使用全長(zhǎng)cDNA，就能反映Subtraction cDNA的全長(zhǎng)。

Ａ：●　只要改變Tester和Driver，就能進(jìn)行反向削減。

Ａ：●　制備的Subtraction cDNA可以立刻應(yīng)用于各種用途。

Ａ：●　制備的Subtraction cDNA中，混入管家基因的量少，所以它還可以作為載體亞克?。ㄏ到y(tǒng)序列）和DNA芯Ａ：　片的探針使用。

Ｑ： 　與PCR-Select法有什么不同？

Ａ：　

	起始材料	接頭添加	雜交次數(shù)	house-keeping基因污染
DsDD法	cDNA庫(kù)或5’和3’末端帶接頭的cDNA	不必要	1次	已經(jīng)分解去除， 污染小
PCR-Select法	RNA	必要	2次	未經(jīng)分解去除， 有污染的可能性

●　PCR-Select法每次都需要通過(guò)RNA制備cDNA，DsDD法則只需cDNA庫(kù)就能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，采用PCR-Select法必須用Rsal（4堿基內(nèi)切酶）酶切，將低分子化的接頭分子與3’或5’端結(jié)合。而DsDD不需要。因此最終的Subtraction cDNA能反映最初的Tester cDNA的狀態(tài)。

●　PCR-Select法需要進(jìn)行兩次雜交，而DsDD法只需一次。

●　PCR-Select法需要從大量cDNA樣品中用Supression-PCR對(duì)SubtactedcDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而DsDD法則是通過(guò)對(duì)與管家基因等共同表達(dá)的基因進(jìn)行雜交后，用分解去除的方式，極力減少管家基因的污染。DsDD法的原理上是形成Subtraction cDNA群，因此可以直接應(yīng)用于克隆和DNA芯片的制作。

Ｑ： 　操作DsDD法時(shí)，特別需要注意的事項(xiàng)是什么？

Ａ：1.     使用Tester，運(yùn)用單向插入的cDNA庫(kù)。

Tester的cDNA庫(kù)，必須對(duì)載體使用單向插入的cDNA庫(kù)。若不用單向cDNA庫(kù)，即使是用λ核酸外切酶處理成單鏈，有意鏈和反意鏈的cDNA會(huì)混為一體，Tester聚集雜交，是降低Subtraction效率的主要原因。

Ａ：2.     使用去除低分子DNA的色譜柱

DSN(Duplex-specific nuclease)是8bp以上的完全一致的雙鏈DNA分解酶，因此其短斷片殘留多。在乙醇沉淀中，無(wú)法去除這些斷片或引物。引物殘留的非特異性雜交，是DSN的非特異性分解的原因。DSN的分解產(chǎn)物在最后的PCR時(shí)，變成非特異性引物，是形成低分子斷片等非特異性斷片增加的原因。

Ａ：3.     用乙醇共沉淀時(shí)，務(wù)必使用配套的Ethachinmate（乙醇沉淀核酸載體）

共沉淀時(shí)使用tRNA等核酸，會(huì)與Tester cDNA發(fā)生非特異性雜交。引起DSN的非特異性分解。

而Ethachinmate（乙醇沉淀核酸載體）是聚丙烯酰胺類(lèi)的共沉淀劑，DNA回收率高達(dá)100%。即使通常不可見(jiàn)的沉淀也可以變?yōu)榭梢?jiàn)，在操作移液器時(shí)避免誤吸。

Ａ：4.     使用適用于1μl的移液器。

Ａ：1μl的移液操作時(shí)，盡可能使用合適的吸移管操作（如Gilson公司的PIPETMAN 2P）。特別是在進(jìn)行雜交時(shí)，Tester ssDNA和Driver dsDNA需要注意移液操作。這一操作中，Tester：Driver=1:200這一比率的把握尤為重要，盡可能減小在移液移過(guò)程中的誤差。

Ａ：5.     酶反應(yīng)時(shí)使用PCR管。
說(shuō)明書(shū)記載DNA擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)盡可能使用PCR管。PCR熱效率較好可以進(jìn)行正確的反應(yīng)。

Ｑ： 　除試劑盒外還需準(zhǔn)備什么？

Ａ：1.     Tester和Driver擴(kuò)增用的cDNA庫(kù)

Ａ：2.     Tester和Driver擴(kuò)增用的Primer

Ａ：3.     參照基因擴(kuò)增用Primer（GAPDH、β-Actin等）

Ａ：4.     DNA聚合酶（TOPOTAQ DNA polymerase等）

Ａ：5.     ｄN(xiāo)TP Mixture

Ａ：6.     低分子DNA和Primer去除用色譜柱

Ａ：7.     限定性酶

Ａ：8.     苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)

Ａ：9.     70％、99.5％乙醇

Ａ：10.   DNA分子量marker

Ａ：11.   瓊脂糖

Ａ：12.   溴化乙錠

Ａ：13.   1×TAE　Buffer

Ａ：14.   Loading Buffer

Ａ：15.   滅菌蒸餾水

Ｑ： 　DsDD是什么的縮寫(xiě)？

Ａ：　DsDD是Duplex-specific Direct Digestion(雙鏈特異性直接消化)的縮寫(xiě)。通過(guò)Duplex-specific DNA Nucelase，可以特異性切斷雜交形成的DNA群。

Ｑ： 　Tester和Driver是什么？

Ａ：　特異性表達(dá)的cDNA端叫“Tester”，作為基準(zhǔn)的cDNA一般稱(chēng)為“Driver”。從癌特異性cDNA庫(kù)制備的cDNA為“Tester”，正常細(xì)胞來(lái)源的cDNA庫(kù)配制的cDNA則為“Driver”。

Ｑ： 　應(yīng)選用何種凝膠過(guò)濾柱？

Ａ：　可以使用能去除100bp以下的，市面售賣(mài)的凝膠過(guò)濾柱。Code No.：195-14451 Spin Cleaner

Ｑ： 　雜交一定要經(jīng)過(guò)16小時(shí)么？

Ａ：　16~20小時(shí)都是沒(méi)有問(wèn)題的。建議16個(gè)小時(shí)是因?yàn)榭紤]到從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天17點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行雜交的話，第二天上午9點(diǎn)就可以進(jìn)行下一項(xiàng)操作。

Ｑ： 　按照protocol制備Driver ds cDNA，但還是不能配出200ng/μl的濃度，應(yīng)該如何解決？

Ａ：　濃度比較小的時(shí)候，請(qǐng)用乙醇共沉淀法操作。離心管中加入Tester 1ng、Driver 200ng后，加入無(wú)菌水100μL，Ethachinmate 1μL，3mol/L的Sodium Acetate 10μL，乙醇250μL，振蕩混合后進(jìn)行離心。然后去除上清，加入150μL 70%的乙醇離心后，去除上清，干燥，再加入3μL的滅菌蒸餾水進(jìn)行溶解。備用于雜交試驗(yàn)。

雜交操作中Tester：Driver=1:200的比率十分重要。乙醇沉淀導(dǎo)致部分DNA缺失是沒(méi)有問(wèn)題的。

Ｑ： 　DSN (Duplex-specific nuclease)有什么優(yōu)點(diǎn)？

Ａ：　DSN是堪察加蟹肝臟來(lái)源的新型雙鏈特異性DNA分解酶，可在雙鏈DNA或DNA-RNA雜交過(guò)程中特異性切斷DNA。最適宜溫度55~65℃，Mg2+條件下，可用EDTA抑制其活性。因?yàn)镈SN能在高溫環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，所以在DsDD法中，進(jìn)行嚴(yán)格性較高的雜交反應(yīng)。

Ｑ： 　一定要使用PCR管嗎？

Ａ：　說(shuō)明書(shū)記載DNA擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)盡可能使用PCR管。熱效率較好能進(jìn)行正確的反應(yīng)。

Ｑ： 　Drive ds cDNA的限定性酶處理是必要的么？

Ａ：　Tester和Driver的載體相同時(shí)，需要進(jìn)行限定性酶處理。目的是防止因Primer結(jié)合引起非特異性雜交而導(dǎo)致DSN分解。用限定性酶只剪切Tester和Driver的cDNA，相輔的cDNA雜交。通過(guò)改變Tester和Driver端的Primer set，進(jìn)而減少非特異性雜交。

Ｑ： 　擴(kuò)增的Tester和Driver側(cè)的Primer set可以是相同的嗎？

Ａ：　同一Set也可以，但不是酶處理本身100%的反應(yīng)。未處理的Driver cDNA Primer和Tester sscDNA的Primer結(jié)合，會(huì)通過(guò)DSN被分解。為了防止上述情況，建議擴(kuò)增Tester和Driver端的PrimerSet還是要區(qū)分開(kāi)。

Ｑ： 　限定性酶處理時(shí)如果出現(xiàn)Driver cDNA的內(nèi)部被切斷的話，會(huì)有影響嗎？

Ａ：　沒(méi)有影響。即使被切斷了，還是能與Tester sscDNA進(jìn)行雜交。

Ｑ： 　一定要進(jìn)行Exonuclease I處理嗎？

Ａ：　不是必要的操作。對(duì)Subtraction cDNA使用標(biāo)記探針時(shí)，Exonuclease I能分解Driver的cDNA，可降低背景。

Ｑ： 　最后，擴(kuò)增削減cDNA用到的Primer需要進(jìn)行磷酸化嗎？

Ａ：　不用，而是需要合成新的Primer。可以的話，建議使用最初的Primer內(nèi)側(cè)區(qū)域的Primer進(jìn)行PCR操作。

Q: 配制Tester cDNA和Driver cDNA時(shí)使用的plasmid DNA會(huì)有影響嗎？

Ａ：　沒(méi)有影響的。DsDD法用的是雙鏈特異性DNA分解酶（DSN），可分解plasmid DNA，所以不會(huì)影響。像生物素結(jié)合法、乳膠微粒oligo(dT)固相法這些傳統(tǒng)方法，無(wú)法去除plasmid DNA，才會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)換和探針的制備等產(chǎn)生影響。

Ｑ： 　說(shuō)明書(shū)推薦的TOPOTAQ DNA polymerase有什么特點(diǎn)？

Ａ：　本產(chǎn)品是Pyrococcus DNA polymerase和Taq DNA polymerase來(lái)源的催化結(jié)構(gòu)域和甲烷細(xì)菌Methanopyruskandleri來(lái)源的非特異性DNA結(jié)合域融合的新型耐熱性DNA Polymarase。本酶家族帶有拓樸異構(gòu)酶活性。通過(guò)這個(gè)特性，僅通過(guò)酶反應(yīng)就能擴(kuò)增GC-rich領(lǐng)域。這是目前其他酶都無(wú)法輕易做到的。TOPOTAQ DNA polymerase有熱啟動(dòng)功能，能抑制非特異性的擴(kuò)增。

Ｑ： 　Ethachinmate是什么？

Ａ：　Ethachinmate由NipponGene生產(chǎn)的，在核酸（DNA或RNA）被乙醇或異丙醇沉淀時(shí)使用的高分子載體。使用本品，能從濃度低的核酸溶液中定量回收微量核酸。加入乙醇或異丙醇后，無(wú)需進(jìn)行-20℃或-80℃冷卻，可直接離心?；厥盏暮怂嵊镁彌_液溶解后，可直接作為各種酶的基質(zhì)使用。

Ｑ： 　去除的Subtracted cDNA有多大？

Ａ：　和光確認(rèn)的大小為500~1500bp。最初用的cDNA庫(kù)和DNA擴(kuò)增的的延伸時(shí)間會(huì)影響Subtracted cDNA的大小。

Ｑ： 　Subtraction的效率是多少？

Ａ：　Tester端用肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)源的cDNA，Driver端用人正常肝臟組織由來(lái)cDNA的話，Real-time PCR過(guò)程中GAPDH會(huì)被抑制至1/1,000。

Ｑ： 　對(duì)削減的基因進(jìn)行亞克隆化，什么方法比較好？

Ａ：　一般采用的方法是：TA克隆或限定性酶處理后，插入目的載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

Ｑ： 　證明cDNA削減的方法是什么？

Ａ：　配制的Subtracted cDNA經(jīng)過(guò)TA克隆后，在菌落PCR確認(rèn)插入斷片，接合探針，通過(guò)其在市面售賣(mài)的mRNA點(diǎn)膜上的斑點(diǎn)，判斷是否有組織特異性基因存在的。還可以在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索序列，或解析DNA芯片的方法。