ProteoStat 蛋白聚集檢測(cè)

　　某些肽鏈在經(jīng)過(guò)錯(cuò)誤折疊后很容易形成聚集，在生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域，這些聚集會(huì)嚴(yán)重影響蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用。許多以蛋白多肽為基礎(chǔ)研發(fā)的藥物具有極大的應(yīng)用前景，可是蛋白因錯(cuò)誤折疊而導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化形成聚集，使蛋白失活，最終影響藥物療效，造成不可估計(jì)的損失。污染物導(dǎo)致的蛋白聚集包括宿主細(xì)胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的損傷形式。

　　基于此Enzo Life Sciences 推出了新產(chǎn)品ProteoStat™ Protein Aggregation Assay，內(nèi)含紅色熒光信號(hào)染料，可特異性結(jié)合聚集蛋白，進(jìn)行檢測(cè)。具有最廣泛的檢測(cè)范圍，可有效檢測(cè)可見和不可見的蛋白微粒。

 ◆原理

　　蛋白聚集嚴(yán)重影響以蛋白為基礎(chǔ)研發(fā)的藥物。在藥物制劑中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影響藥效。

　　蛋白聚集發(fā)生在生產(chǎn)過(guò)程的各個(gè)階段包括細(xì)胞培養(yǎng)、純化、生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)确矫妗Ｖ扑幑I(yè)希望在生物工藝中找到新的方法，可用于檢測(cè)、追蹤、定量分析影響蛋白聚集的因素。

　　近年來(lái)以凍干穩(wěn)定形式存在的蛋白聚集體作為標(biāo)準(zhǔn)品，可以準(zhǔn)確地定量檢測(cè)蛋白聚集，加上新穎的只需在酶標(biāo)儀里即可實(shí)驗(yàn)的ProteoStat^? protein aggregation assay，可對(duì)蛋白檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。

　　在這篇文章中，使用已知濃度的聚集IgG標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)ProteoStat^? protein aggregation assay/standards對(duì)IgG的聚集水平進(jìn)行檢測(cè)，集中分析了制藥工業(yè)中常見的3種聚集形式。

　　●    熱誘導(dǎo)聚集

　　●    機(jī)械誘導(dǎo)聚集

　　●    冷凍和反復(fù)凍融誘導(dǎo)聚集

◆優(yōu)點(diǎn)?特色

　●　高通量篩選方法用于流式細(xì)胞儀平臺(tái)監(jiān)測(cè)蛋白穩(wěn)定性

　●　在熒光微孔板中即可進(jìn)行簡(jiǎn)單、靈敏、均一地檢測(cè)

　●　不需分離目的蛋白或稀釋樣品

　●　與傳統(tǒng)蛋白聚集檢測(cè)染料相比更靈敏，信號(hào)更明亮

　●　優(yōu)化的緩沖液和輔料用于蛋白制劑研發(fā)

　●　檢測(cè)靈敏度可低至亞微摩爾級(jí)別，含量在1%-5%的聚集蛋白也能被檢測(cè)出

　●　在廣泛的PH（4-10）和離子強(qiáng)度范圍都可使用，提供至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)的線性動(dòng)態(tài)范圍

　●　使用ProteoStat^? 蛋白聚集檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品可對(duì)溶液中的聚集蛋白精確定量

　●　可檢測(cè)蛋白多肽聚集程度，可用于篩選蛋白聚集激活劑或抑制劑

在蛋白聚集實(shí)驗(yàn)研究中，將ProteoStat protein aggregation assay和Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader聯(lián)用，可適合用于監(jiān)測(cè)由溫度、機(jī)械損傷和反復(fù)凍融所引起的蛋白聚集。

穩(wěn)定的蛋白顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)品可快速建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，加快定量分析蛋白聚集響應(yīng)。這個(gè)檢測(cè)方法能夠可靠地檢測(cè)到濃縮抗體制劑中小于0.2%的聚集蛋白，線性動(dòng)態(tài)范圍為2個(gè)數(shù)量級(jí)。

ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards檢測(cè)蛋白聚集特點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，能夠檢測(cè)低水平的蛋白聚集情況，只需30分鐘，就能夠得到完整的分析結(jié)果。

案例一 不同攪拌速率對(duì)蛋白聚集的影響	案例二 蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集
使用本產(chǎn)品檢測(cè)后，可知攪拌速度越快，蛋白聚集程度越大。	藍(lán)色曲線為對(duì)照，沒(méi)有攪拌速度在300rpm下，綠色曲線與紅色曲線分別表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情況與天然蛋白的聚集情況。使用本產(chǎn)品檢測(cè)后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

使用流式細(xì)胞儀結(jié)合ProteoStat? 蛋白聚集分析試劑盒使用例
A ProteoStat? 蛋白聚集分析試劑盒檢測(cè)IgG 聚集標(biāo)準(zhǔn)品 B ProteoStat? 蛋白聚集分析試劑盒檢測(cè)硅油滴 C ProteoStat? 蛋白聚集分析試劑盒檢測(cè)IgG 聚集標(biāo)準(zhǔn)品和硅油滴的混合物 使用流式細(xì)胞儀結(jié)合ProteoStat? 蛋白聚集分析試劑盒檢測(cè)IgG 聚集標(biāo)準(zhǔn)品，可與其他非蛋白微粒如油滴區(qū)別開來(lái)，且無(wú)須考慮樣品微粒大?。ń?jīng)檢測(cè)>97%的IgG 聚集標(biāo)準(zhǔn)品都小于2μm）。

案例?應(yīng)用

材料和方法

　　Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards，利用熒光分子信號(hào)染料可特異性結(jié)合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可檢測(cè)。

探針在溶液中是不發(fā)出熒光的，當(dāng)與聚集蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出明亮的熒光。一旦聚集標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生重組，它們將含有0-12.5%的聚集蛋白，總蛋白濃度維持在1mg/mL。

通過(guò)粒子分析成像鑒定標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)現(xiàn)90%的蛋白聚集體長(zhǎng)度為2-10μm，約9%的蛋白聚集體長(zhǎng)度為10-20μm，約0.7%的蛋白聚集體為長(zhǎng)度大于20μm。

Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments) 可用于所有蛋白聚集分析。它的激發(fā)波長(zhǎng)為500nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為9nm，便于檢測(cè)ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激發(fā)單色器激發(fā)波長(zhǎng)為435nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495nm，都在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為9nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)。

 

結(jié)果

在96孔微板中檢測(cè)比較ProteoStat和Thioflavin T染料與蛋白聚集的結(jié)合能力。純化的兔抗羊lgG(4.26mg/mL)在pH2.7的鹽酸水溶液中，80℃溫度下孵育90分鐘后會(huì)形成蛋白聚集體。

聚集信號(hào)由聚合體和單體混合比例不同決定的，但總的lgG蛋白濃度仍然是60μg/mL。在50 mM磷酸鉀，pH7，3μM ProteoStat 檢測(cè)試劑或5μM Thioflavin T 染料中讀數(shù)。這些濃度在以前做過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)確定是最優(yōu)的濃度。

在蛋白和染料一起孵育15分鐘后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader讀數(shù)。所用的板為Greiner μClear^? black, clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。

在相同情況下，ProtesStat染料的熒光強(qiáng)度比Thioflavin T染料高100倍。對(duì)于濃度為1.2μg/mL的聚集體，ProteoStat染料的信噪比為12.8，而Thioflavin T染料的信噪比僅為1.2，表明ProteoStat染料在蛋白聚集檢測(cè)中更準(zhǔn)確、靈敏度更高。

正因?yàn)橛纱孙@著的優(yōu)勢(shì)，ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能夠共同用于各種常規(guī)形式的蛋白聚集檢測(cè)。

 

監(jiān)控?zé)嵴T導(dǎo)聚集

當(dāng)?shù)鞍资艿教岣邷囟却碳?huì)加速其聚集。羊lgG(4mg/mL)在各個(gè)時(shí)期都處于攪拌速度400rmp，100mM磷酸鈉，pH7.2，溫度60℃下。

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，25μL lgG用于測(cè)量。首先樣本在1x assay buffer中稀釋4倍后，得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個(gè)孔中加入98uL的檢測(cè)蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都做平行孔。

同時(shí)，ProteoStat protein aggregation standards中含有穩(wěn)定的、高質(zhì)量的對(duì)照樣本，用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如圖1所示，使用ProteoStat染料檢測(cè)羊lgG在熱誘導(dǎo)下的聚集情況，生成的曲線表明不同階段lgG蛋白聚集的情況。

在剛開始階段蛋白聚集情況較少，接著觀察到生長(zhǎng)階段聚集體開始形成，最后生長(zhǎng)率降低直至變成0，表明蛋白單體已幾乎消失，差不多完全形成聚集體。

圖1：熱誘導(dǎo)羊IgG蛋白聚集

 

監(jiān)控機(jī)械誘導(dǎo)聚集

雖然普遍認(rèn)為機(jī)械攪拌會(huì)加速蛋白聚集形成，但目前機(jī)械外力造成蛋白聚集形成的原理還不是十分明確。在藥物研發(fā)中，可能受到抽真空或者過(guò)濾等產(chǎn)生的機(jī)械外力使蛋白藥物形成聚集。

羊抗鼠lgG(10mg/mL)溶解在含有10mM的磷酸鈉，150mM Nacl，0.05% 疊氮化鈉，pH7.2的溶液中。機(jī)械攪拌的實(shí)驗(yàn)條件如下：室溫、4mL的平底褐色玻璃瓶中加入200μL lgG溶液，使用Variomag^? Poly electronic stirrer (2Mag-USA)，以990rpm速度進(jìn)行攪拌。攪拌棒體積為1.0×0.4×0.2cm³。

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取10μL lgG用于檢測(cè)。樣品在1×assay buffer中稀釋10倍后，得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個(gè)孔中加入98uL的檢測(cè)蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都做平行孔。

用ProteoStat protein aggregation standards作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)機(jī)械攪拌誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白聚集。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白聚集與時(shí)間成正比例關(guān)系（圖2）。

圖2：機(jī)械誘導(dǎo)樣抗鼠IgG蛋白聚集

 

監(jiān)控冷凍和反復(fù)凍融誘導(dǎo)聚集

冷凍對(duì)于蛋白穩(wěn)定是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诶鋬鲞^(guò)程中會(huì)導(dǎo)致溶液的濃度發(fā)生變化。羊抗鼠lgG(10mg/mL) 溶解在10mM的磷酸鈉，150mM Nacl，0.05% 疊氮化鈉，pH7.2的溶液中。樣品保存在-20℃，反復(fù)凍融數(shù)次。

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取10μL lgG用于檢測(cè)。樣品在1×assay buffer中稀釋10倍后，得到的蛋白最終濃度為1mg/mL。在每個(gè)孔中加入98μL的檢測(cè)蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做平行孔。

用ProteoStat protein aggregation standards作標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)反復(fù)凍融誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白聚集體。實(shí)驗(yàn)表明反復(fù)凍融也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白聚集。與熱誘導(dǎo)引起蛋白聚集一樣，會(huì)觀察到一條S型曲線圖。