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ScreenFect ™ 通信 向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入siRNA數(shù)據(jù)

 

下面為大家介紹使用ScreenFect ™ siRNA向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入siRNA數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)成果及逆轉(zhuǎn)染（1-STEP）Protocol。

◆向HeLa細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)染例子（24孔培養(yǎng)板）

細(xì)胞的前期培養(yǎng)

1.     用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器（T-75燒瓶），將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至半融合狀態(tài)。

配制轉(zhuǎn)染試劑

1.     準(zhǔn)備兩支1.5 mL滅菌試管。

2.     在其中一支試管里加入24.5 μL ScreenFect ™ Dilution buffer。

3.     再往步驟2的試管里加入0.5 μL的ScreenFect ™ siRNA reagent，

        使全部容量達(dá)到25 μL?！芤海ˋ）

      （ScreenFect ™ siRNA reagent在使用前進(jìn)行渦旋處理。）

4.     在另一支試管里加入24 μL ScreenFect ™ Dilution buffer。

5.     再向步驟4的試管里加入1 μL的5μmol/L PIK3CB siRNA溶液（5 pmol）…溶液（B）

6.     將溶液（B）全部添加至溶液（A）的試管中。

7.     輕敲試管，使溶液混合均勻。再用臺(tái)式離心機(jī)降速處理。

8.     在室溫下孵浴5~20分鐘。

配制配制細(xì)胞懸浮液

1.     從恒溫箱里取出【細(xì)胞的前期培養(yǎng)】的燒瓶。

2.     去除培養(yǎng)基，用PBS清洗一次。

3.     向燒瓶里添加2 mL胰蛋白酶溶液后，放入室溫、5%CO₂的恒溫箱里培養(yǎng)，

        直到細(xì)胞從培養(yǎng)容器中脫落。

4.     加入約5 mL FBS添加培養(yǎng)基使反應(yīng)停止。

5.     利用移液器使細(xì)胞分散，將全部培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中。

6.     150×g離心，5分鐘。

7.     去除上清時(shí)不要去掉顆粒物。

8.     添加5~10 mL新的培養(yǎng)基，利用移液器使細(xì)胞分散。

9.     用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等的細(xì)胞計(jì)算器檢測(cè)細(xì)胞數(shù)。

10.  檢測(cè)出細(xì)胞懸浮液的濃度后經(jīng)過(guò)計(jì)算，以此配制2.0×10⁵ cells/mL的細(xì)胞懸浮液。

     （配制的細(xì)胞懸浮液量可根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。）

轉(zhuǎn)染

1.     將500 μL在【配制細(xì)胞懸浮液】時(shí)配制好的細(xì)胞懸浮液添加至細(xì)胞培養(yǎng)板里。

2.     將50 μL在【配制轉(zhuǎn)染試劑】步驟8中孵浴的DNA-lipid complex添加至細(xì)胞培養(yǎng)板里，

        輕搖培養(yǎng)板使溶液混合（也可以先往細(xì)胞培養(yǎng)板里加入50 μL DNA-lipid complex，

        再加入500 μL細(xì)胞懸浮液）。

3.     放入CO₂的恒溫箱里培養(yǎng)24~48小時(shí)后即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 

 

◆實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

　　用逆向轉(zhuǎn)染法和正向轉(zhuǎn)染法向HeLa細(xì)胞進(jìn)行PIK3CB siRNA的導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)出PIK3CB mRNA的表達(dá)量。將定量結(jié)果得出的敲減效率，與原來(lái)用其他公司的產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得出的敲減效率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，ScreenFect ™ siRNA擁有高于其他公司產(chǎn)品抑制目的基因表達(dá)的效率。

【逆向轉(zhuǎn)染（1-STEP）】

【正向轉(zhuǎn)染（2-STEP）】

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	包裝
299-75001	ScreenFect ™ siRNA轉(zhuǎn)染試劑 ScreenFect ™ siRNA	基因研究用	0.2 mL
295-75003			1 mL
293-75004			1 mL×5