粘蛋白檢測(cè)試劑盒

Mucin Assay Kit

——健康和美容研究試劑

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◆背景

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　　粘蛋白屬于高度糖基化蛋白質(zhì)家族，是粘膜的主要成分，例如唾液，淚液，胃液，腸液。粘蛋白的 基本構(gòu)型是枝狀糖鏈連接到多肽的大分子。糖鏈的非均質(zhì)特性使其具有多樣性，分子具有各種功能，如特異性分子識(shí)別。
一些糖鏈識(shí)別病毒和細(xì)菌的特定蛋白質(zhì)。粘蛋白錨定在腸中粘膜屏障功能中，阻止病原體和毒素通過(guò)腸壁進(jìn)入血管中。該試劑盒可用于檢測(cè)糞便中的粘蛋白含量。
粘蛋白屬于高分子（1000kda-10000kda）高度糖基化蛋白的家族。蛋白質(zhì)核內(nèi)的粘蛋白結(jié)構(gòu)域富含蘇氨酸、絲氨酸和羥脯氨酸，糖鏈的還原末端（GalNAc）通過(guò)翻譯后O-糖基化與這些氨基酸頻繁連接。該試劑盒具有確定糞便粘蛋白含量組分的功能。
糞便粘蛋白測(cè)定可用作腸屏障功能的指標(biāo)。該試劑盒利用熒光檢測(cè)來(lái)測(cè)定粘蛋白的含量。

　　我們提供的該試劑盒可以供研究功能性食物和感染的客戶使用。

　　步驟1：從糞便中提取和部分純化粘蛋白。
步驟2：粘蛋白O-糖苷連接的寡糖鏈的測(cè)定通過(guò)稀堿進(jìn)行β-消除，形成糖鏈的還原端。還原碳水化合物在高溫下進(jìn)行熒光標(biāo)記以產(chǎn)生熒光縮合物。

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粘蛋白的結(jié)構(gòu)

?◆試劑盒組分

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◆優(yōu)點(diǎn)?特色

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●? 粘蛋白和IgA能阻止細(xì)菌和毒素的入侵

●? 作為腸屏障的一部分，粘蛋白和IgA能防止病原菌和毒素通過(guò)腸壁轉(zhuǎn)移到血管內(nèi)。

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測(cè)定理論
通過(guò)對(duì)糞便中的β-葡萄糖苷酶熱變性防止糞便粘蛋白降解
↓
粗提取粘蛋白
↓
用酶溶液分解淀粉
↓
用乙醇沉淀純化粘蛋白
↓
將試劑A加入純化的粘蛋白中，并在堿性條件下進(jìn)行熱處理。 （試劑A將與粘蛋白的糖還原末端反應(yīng)，并在堿處理后發(fā)出熒光）
↓
加入緩沖液C并測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)336nm，熒光383nm）

　?。ň唧w操作請(qǐng)看相關(guān)資料）

◆案例?應(yīng)用

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喂食高脂肪食物的大鼠腸屏障部分注射多酚的效果

圖1 粘蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 糞便中的粘蛋白含量

應(yīng)用

　　用于測(cè)定糞便中的粘蛋白含量。

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相關(guān)資料

Mucin_Assay_Kit.

◆操作步驟

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●　本產(chǎn)品是專為熒光酶標(biāo)儀測(cè)量設(shè)計(jì)（96孔板）。
●　當(dāng)使用熒光讀板機(jī)時(shí)，可測(cè)量100個(gè)樣品。
●　當(dāng)使用分光光度計(jì)測(cè)量時(shí)，請(qǐng)使用微細(xì)胞。

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緩沖液A的制備
用100mL蒸餾水溶解1塊片劑。
糞便粉末的制備：糞便凍干并在研缽中研磨，儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

II.糞便粘蛋白的測(cè)定
1、稱量100mg糞便粉末放入微量試管（2mL）中，加入1mL緩沖液A，然后用渦流混合器混合30秒鐘。

　　2、在95℃下加熱試管10分鐘使細(xì)菌的糖苷酶變性。

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　　3、在37℃下加熱90分鐘，從糞便中提取粘蛋白。

　　4、在4℃下離心20,000×g 15分鐘。
5、將200μL上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量試管中，加入200μL緩沖液B，用渦流混合器混合溶液。

　　6、加入10μL酶溶液混合，在50℃下加熱試管20分鐘分解淀粉。
7、將離心管冷卻至室溫，加入125μL的99.5％乙醇，混合后，在-20℃下靜置過(guò)夜。

　　8、次日，在4℃下20,000×g離心10分鐘，去上清。向沉淀加入1mL緩沖液A，重溶沉淀。（樣品溶液）

　　9、將20uL樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量試管（500uL）中，加入24uL試劑混合物（使用前以1:5混合試劑A和試劑B），混合后， 100℃下加熱微量試管30分鐘。

　　10、冷卻至室溫，加入200uL緩沖液C，用渦流混合器混合。

　　11、將100μL溶液轉(zhuǎn)移到96孔黑色孔板中，并在波長(zhǎng)（例如：336nm em：383nm）實(shí)用熒光讀板機(jī)測(cè)量熒光強(qiáng)度。
12、通過(guò)如下所示的連續(xù)稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。 通過(guò)這些點(diǎn)繪制平滑曲線以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品的濃度。
13、計(jì)算1g糞便中的粘蛋白含量。步驟（12）測(cè)得的值的50倍是1g糞中的粘蛋白含量。

工作校準(zhǔn)品：N-乙酰葡萄糖胺250μg/ mL
●　通過(guò)連續(xù)稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下圖所示。
●　剩余的未稀釋校準(zhǔn)品應(yīng)儲(chǔ)存在2-10°C。
●　稀釋校準(zhǔn)品穩(wěn)定，可在2-10°C保存1個(gè)月。

參考文獻(xiàn)

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