深層組織的高分辨率·高亮度分析

SeeDB2

SeeDB2是由柯孟岑、今井猛博士等人開發(fā)的一種新型組織透明化試劑。特別適用于通過熒光蛋白標(biāo)記樣本的3D高分辨率成像。

　　對照SeeDB2G的甘油折射率（1.46）和SeeDB2S的油折射率（1.52），分別用甘油浸沒鏡頭和油浸鏡頭觀察，可見即使在深層部分也沒有因?yàn)榍蛎嫦癫疃鹉：ǚ直媛式档停?/span>

　　此外值得注意的是在SeeDB2中，熒光蛋白的熒光保持非常穩(wěn)定，并且優(yōu)于PBS和其他市售的封固劑。因此，SeeDB2十分適合作為熒光蛋白標(biāo)記樣本的封固劑。它不僅可用于厚樣本，還可用于細(xì)胞生物學(xué)的薄樣本和組織切片。

本試劑盒內(nèi)容：1) 皂素、2) SeeDB2G solution、3) SeeDB2S solution、4) PBS

SeeDB2是通過調(diào)整Permeabilization solution、Clearing Solution等各種試劑，可實(shí)現(xiàn)透明化的試劑盒。

數(shù)據(jù)提供：國立研究開発法人理化學(xué)研究所柯孟岑先生、今井猛先生（現(xiàn)九州大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院）

◆SeeDB2組織透明化實(shí)驗(yàn)案例（小鼠腦切片厚度0.5-2 mm）

*在組織透明化實(shí)驗(yàn)中需要注意根據(jù)樣本量調(diào)整試劑量和處理時(shí)間。

圖1.　小鼠腦SeeDB透明化案例

  　 小鼠腦切片（1.5mm厚）的SeeDB2處理前后

圖2.　用共聚焦顯微鏡觀察Thy1-YFP H系小鼠腦切片

◆參考文獻(xiàn)

1.	Ke et al.,: Cell Reports 14, 2718(2016)
2.	SeeDB Resources (https://sites.google.com/site/seedbresources/): updated information and technical TIPs from the authors.

組織透明化配套耗材：成像用透明室

相關(guān)資料

透明化試劑方法選擇流程.pdf

組織透明化試劑Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：組織透明化的原則

Ａ：組織透明化通常是按下面的步驟進(jìn)行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脫色 （d）折射率匹配

 

Q：組織透明化的優(yōu)勢

Ａ：目前大多數(shù)可用的透明化技術(shù)，都是通過編碼熒光報(bào)告蛋白或者用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行后標(biāo)記，從而可視化

Ａ：組織中特定的蛋白。組織透明化成為了具有單細(xì)胞分辨率的組織3D成像中重要的一環(huán)。

 

Q：透明化技術(shù)的比較

Ａ：下面是水性的透明化技術(shù)。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些應(yīng)用中有一定優(yōu)勢。因?yàn)镾eeDB不含去垢劑，所以對于透明化DiI(細(xì)胞膜

Ａ：紅色熒光探針，一種神經(jīng)示蹤劑)標(biāo)記的樣品和使用光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（CLEM）的情況下，SeeDB有著一定優(yōu)

Ａ：勢。另外SeeDB會產(chǎn)生自體熒光，有時(shí)候會對辨認(rèn)未標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)氈）起著一定幫助。

Ａ：SeeDB2是為使用高NA物鏡的高分辨率成像而優(yōu)化的技術(shù)；因此，當(dāng)處理較大的組織時(shí)，CLARITY或者CUBIC

Ａ：會是更好的選擇。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您應(yīng)該根據(jù)您的物鏡的WD（工作距離）來決定切片的厚度。我們建議切片的厚度不要超過3mm。對于十分薄

Ａ：且脆弱的樣品，我們建議使用瓊脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以讓全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重復(fù)性。

 

Q：試劑盒成分

Ａ：具體如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S試劑盒（299-79001）適用于20份1-2mm的切片樣品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S試劑盒（290-80801）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB試劑盒（299-79901）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2試劑盒（294-80701）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：樣品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S處理的樣品應(yīng)在室溫下保存2至3周。您可以在2至3周內(nèi)觀察SCALEVIEW-S透明化的樣品中的

Ａ：熒光信號。

Ａ：CUBIC處理的樣品應(yīng)在室溫下保存1周。您可以在1周內(nèi)觀察CUBIC透明化的樣品中的熒光信號。

Ａ：SeeDB2G處理的樣品應(yīng)在冰箱中保存1年，而SeeDB2S處理的樣品則可在室溫下保存1年。您可以在1年內(nèi)觀

Ａ：察SeeDB透明化的樣品中的熒光信號。

 

Q：抗體的熒光標(biāo)記

Ａ：應(yīng)在進(jìn)行透明化前就進(jìn)行抗體的熒光標(biāo)記。

 

Q：適用于SCALEVIEW-S的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：適用于CUBIC的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：適用于SeeDB2的顯微鏡

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸鏡頭）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用復(fù)合浸沒鏡頭）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸鏡頭）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制鏡面的設(shè)備）

 

Q：重構(gòu)

Ａ：對于定量用途，我們建議使用Neurolucida系統(tǒng)（MBF）。我們同樣測試了VAST Lite用于成像用途時(shí)的表

Ａ：現(xiàn)。重構(gòu)時(shí)也可以使用開源軟件。例如，Vaa3d可以處理大量的拼接圖像的數(shù)據(jù)。

 

Q：物鏡推薦

 

Q：其他物種？其他器官？

Ａ：對于昆蟲樣品和魚類樣品，建議選擇CUBIC。

Ａ：昆蟲相關(guān)文獻(xiàn)：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：魚類相關(guān)文獻(xiàn)：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　對于多細(xì)胞球狀體，選擇SCALEVIEW-S會更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

參考文獻(xiàn)

1.	Ke et al.,: Cell Reports 14, 2718(2016)
2.	SeeDB Resources (https://sites.google.com/site/seedbresources/): updated information and technical TIPs from the authors.