CUBIC 組織透明化試劑

具有單細(xì)胞分辨率的全腦/全身成像

＊數(shù)據(jù)由Etsuo A Susaki博士和 Hiroki R. Ueda, RIKEN博士提供

Hiroki R. Ueda博士等人開發(fā)了一種簡單、高效、可擴(kuò)展的腦/體透明化方法和成像/計(jì)算分析方法，CUBIC（clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis）。 　　CUBIC是一種基于親水溶液（ScaleCUBIC Solutions）的、具有熒光保護(hù)、高性能及無需特殊設(shè)備等特點(diǎn)的組織透明化方法。 　　它可以利用LSFM技術(shù)實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的整個(gè)器官和全身的透明化以及快速3D成像。CUBIC還提供3D圖像的處理和分析，以提取生物信息。 　　所以，CUBIC提供了具有單細(xì)胞分辨率和圖像信息學(xué)的全器官/全身成像平臺，使廣大用戶能夠針對細(xì)胞和器官層進(jìn)行多個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)。

◆CUBIC的優(yōu)點(diǎn)

●　易于使用

●　無需特殊設(shè)備

●　支持后續(xù)的2D H＆E染色

●　高透明度

●　適用于多種器官

●　兼容IF（免疫熒光），F(xiàn)P（熒光蛋白）和其他熒光標(biāo)記

◆CUBIC的應(yīng)用

**一般情況下，可使用比例為7:3的固定溶液1和2（RI~1.49）混合溶液。

圖1．使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠整體器官的透射圖像

圖2．使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠2mm切片的透射圖像

◆ CUBIC應(yīng)用于熒光蛋白表達(dá)

圖3．CAG-EGFP Tg小鼠（8w雄性）的全腦，全心臟和解剖肝臟的LSFM成像

◆CUBIC應(yīng)用于病理學(xué)方法中

　　數(shù)據(jù)來源于S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017)/已被收錄

圖4．使用CUBIC透明化各種人體器官

使用CUBIC的石蠟樣品的組織透明化和3D成像

圖5．使用CUBIC的病理標(biāo)本的組織透明化和3D成像

◆CUBIC 魚類透明化案例

數(shù)據(jù)提供：東京海洋大學(xué) 海洋生物資源學(xué)院 二見邦彥老師

圖6．使用CUBIC的魚類透明化案例

實(shí)驗(yàn)步驟參見參考文獻(xiàn)5）

圖7．使用CUBIC處理后的魚類內(nèi)臟切片案例

-CUBIC處理后，切片5 μm，可用Mayer’s Hematoxylin染色-

圖8．用抗體觀察CUBIC處理后斑馬魚鰓的內(nèi)臟片

◆CUBIC 甲殼類（螃蟹·鼠婦）透明化案例

數(shù)據(jù)提供：浜松醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)分光應(yīng)用寄附研究生 紺野在老師，岡崎茂俊老師

圖9．使用CUBIC的甲殼類透明化案例（上：螃蟹，下：鼠婦）

實(shí)驗(yàn)步驟參見參考文獻(xiàn)6）

圖10．觀察CUBIC處理后（PI染色）甲殼類的全身（左：螃蟹，右：鼠婦）

實(shí)驗(yàn)步驟參見參考文獻(xiàn)6）

注意：

　　列出的產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用，不得用于藥物、食品或人體。

組織透明化配套耗材：成像用透明室

相關(guān)資料

透明化試劑方法選擇流程.pdf

CUBIC trial manual.pdf

組織透明化試劑Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：組織透明化的原則

Ａ：組織透明化通常是按下面的步驟進(jìn)行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脫色 （d）折射率匹配

 

Q：組織透明化的優(yōu)勢

Ａ：目前大多數(shù)可用的透明化技術(shù)，都是通過編碼熒光報(bào)告蛋白或者用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行后標(biāo)記，從而可視化

Ａ：組織中特定的蛋白。組織透明化成為了具有單細(xì)胞分辨率的組織3D成像中重要的一環(huán)。

 

Q：透明化技術(shù)的比較

Ａ：下面是水性的透明化技術(shù)。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些應(yīng)用中有一定優(yōu)勢。因?yàn)镾eeDB不含去垢劑，所以對于透明化DiI(細(xì)胞膜

Ａ：紅色熒光探針，一種神經(jīng)示蹤劑)標(biāo)記的樣品和使用光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（CLEM）的情況下，SeeDB有著一定優(yōu)

Ａ：勢。另外SeeDB會產(chǎn)生自體熒光，有時(shí)候會對辨認(rèn)未標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)氈）起著一定幫助。

Ａ：SeeDB2是為使用高NA物鏡的高分辨率成像而優(yōu)化的技術(shù)；因此，當(dāng)處理較大的組織時(shí)，CLARITY或者CUBIC

Ａ：會是更好的選擇。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您應(yīng)該根據(jù)您的物鏡的WD（工作距離）來決定切片的厚度。我們建議切片的厚度不要超過3mm。對于十分薄

Ａ：且脆弱的樣品，我們建議使用瓊脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以讓全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重復(fù)性。

 

Q：試劑盒成分

Ａ：具體如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S試劑盒（299-79001）適用于20份1-2mm的切片樣品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S試劑盒（290-80801）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB試劑盒（299-79901）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2試劑盒（294-80701）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：樣品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S處理的樣品應(yīng)在室溫下保存2至3周。您可以在2至3周內(nèi)觀察SCALEVIEW-S透明化的樣品中的

Ａ：熒光信號。

Ａ：CUBIC處理的樣品應(yīng)在室溫下保存1周。您可以在1周內(nèi)觀察CUBIC透明化的樣品中的熒光信號。

Ａ：SeeDB2G處理的樣品應(yīng)在冰箱中保存1年，而SeeDB2S處理的樣品則可在室溫下保存1年。您可以在1年內(nèi)觀

Ａ：察SeeDB透明化的樣品中的熒光信號。

 

Q：抗體的熒光標(biāo)記

Ａ：應(yīng)在進(jìn)行透明化前就進(jìn)行抗體的熒光標(biāo)記。

 

Q：適用于SCALEVIEW-S的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：適用于CUBIC的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：適用于SeeDB2的顯微鏡

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸鏡頭）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用復(fù)合浸沒鏡頭）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸鏡頭）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制鏡面的設(shè)備）

 

Q：重構(gòu)

Ａ：對于定量用途，我們建議使用Neurolucida系統(tǒng)（MBF）。我們同樣測試了VAST Lite用于成像用途時(shí)的表

Ａ：現(xiàn)。重構(gòu)時(shí)也可以使用開源軟件。例如，Vaa3d可以處理大量的拼接圖像的數(shù)據(jù)。

 

Q：物鏡推薦

 

Q：其他物種？其他器官？

Ａ：對于昆蟲樣品和魚類樣品，建議選擇CUBIC。

Ａ：昆蟲相關(guān)文獻(xiàn)：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：魚類相關(guān)文獻(xiàn)：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　對于多細(xì)胞球狀體，選擇SCALEVIEW-S會更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

參考文獻(xiàn)

[1]　E. A. Susaki.et al. : Cell ,157(3),726(2014).

[2]　K. Tainaka.et al. : Cell ,159(4),911(2014).

[3]　E. A. Susaki.et al. : Nature Protocols ,10,1709(2015).

[4]　S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017).

[5]　S. Ohnuma. et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
[6]　A. Konno and S. Okazaki.: Zoological Letters, 4:13(2018).