組織透明化試劑

SCALEVIEW^?-S

　　ScaleS技術由一組主要成分為尿素和山梨糖醇的組織透明化試劑組成。

　　開發(fā)此技術的理化研究所·腦神經(jīng)科學研究中心和光量子工學研究中心通過進一步改良，研發(fā)出兼?zhèn)涑錾该鞫群涂杀Ａ艏毼⒔Y(jié)構及熒光信號的新成果。

　　FUJIFILM Wako取得理化研究所的許可，把此項成果商品化，推出SCALEVIEW^?-S產(chǎn)品。

　　SCALEVIEW^?-S 不僅可以透明化含有熒光蛋白的生物標本，而且也可以有效應用于抗體或熒光染料標記的厚標本。它將有望成為分析腦組織病理標本的有力工具。

　　SCALEVIEW^?-S Trial Kit主要由從SCALEVIEW^?-S0到SCALEVIEW^?-SMt等6種試劑組成，可通過使用各試劑進行透明化的試劑盒。

數(shù)據(jù)提供：

國立研究開發(fā)法人理化學研究所

腦神經(jīng)科學研究中心細胞機能探索研究組/光量子工學研究中心生命光學技術研究組

濱裕先生、星田哲志先生、宮脇敦史先生

合作：olympus株式會社

◆SCALEVIEW^?-S 組織透明化實驗報告例子

■　小鼠大腦半球1-2mm厚切片

（※試劑用量標準：透明化處理和固定各5mL。）

※在組織透明化實驗中，請注意試劑的使用量、處理的時間根據(jù)樣本大小會有所改變。

此外，請盡可能在灌注固定后取出并重新固定樣本。

 

■　使用SCALEVIEW^?-S小鼠大腦透明化例子

從左依次是小鼠大腦切片（1mm厚）SCALEVIEW^?-S處理前后和小鼠大腦半球SCALEVIEW^?-S處理前后

 

■　用雙光子激發(fā)顯微鏡觀察YFP-H line系小鼠透明化全腦——逐步放大基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域

點擊查看protocol

◆免疫組織染色：AbScale 實驗報告

■　小鼠大腦半球1-2mm厚切片

（※試劑用量標準為前處理各試劑：10mL、抗體染色：1.5mL、透明化：10mL、固定：10mL。）

* AbScale Solution : 含0.33 M 尿素、0.1 % (wt/vol) Triton X-100的PBS(-)溶液

 

■　阿爾茨海默病模型小鼠（17個月）大腦切片（2mm厚）通過AbScale法進行免疫組織染色的圖

　  像例

◆熒光染料染色：ChemScale 實驗報告

■　小鼠大腦半球1-2mm厚切片

（試劑用量標準為前處理各試劑：10mL、熒光染料染色：8mL、洗滌：10mL、透明化：10mL）

■　用共聚焦激光掃描顯微鏡（倒立）觀察ChemScale處理（PI染色）后的YFP-H line小鼠大腦半球

     切片（2mm厚）

◆SCALEVIEW^?-S Neurosphere觀察示例

■　Neurosphere

（試劑用量標準：前處理及透明化各試劑1.2mL。※抗體染色基于AbScale實驗報告）

■　從成年大鼠海馬體制備的神經(jīng)干細胞Neurosphere三維免疫染色——使用AbScale法

組織透明化配套耗材：成像用透明室

透明化試劑方法選擇流程.pdf	AbScale發(fā)進行直接IHC實驗步驟.pdf

組織透明化試劑Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：組織透明化的原則

Ａ：組織透明化通常是按下面的步驟進行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脫色 （d）折射率匹配

 

Q：組織透明化的優(yōu)勢

Ａ：目前大多數(shù)可用的透明化技術，都是通過編碼熒光報告蛋白或者用熒光標記抗體進行后標記，從而可視化

Ａ：組織中特定的蛋白。組織透明化成為了具有單細胞分辨率的組織3D成像中重要的一環(huán)。

 

Q：透明化技術的比較

Ａ：下面是水性的透明化技術。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些應用中有一定優(yōu)勢。因為SeeDB不含去垢劑，所以對于透明化DiI(細胞膜

Ａ：紅色熒光探針，一種神經(jīng)示蹤劑)標記的樣品和使用光電關聯(lián)顯微鏡（CLEM）的情況下，SeeDB有著一定優(yōu)

Ａ：勢。另外SeeDB會產(chǎn)生自體熒光，有時候會對辨認未標記的神經(jīng)元結(jié)構（如神經(jīng)氈）起著一定幫助。

Ａ：SeeDB2是為使用高NA物鏡的高分辨率成像而優(yōu)化的技術；因此，當處理較大的組織時，CLARITY或者CUBIC

Ａ：會是更好的選擇。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您應該根據(jù)您的物鏡的WD（工作距離）來決定切片的厚度。我們建議切片的厚度不要超過3mm。對于十分薄

Ａ：且脆弱的樣品，我們建議使用瓊脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以讓全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重復性。

 

Q：試劑盒成分

Ａ：具體如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S試劑盒（299-79001）適用于20份1-2mm的切片樣品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S試劑盒（290-80801）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB試劑盒（299-79901）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2試劑盒（294-80701）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：樣品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S處理的樣品應在室溫下保存2至3周。您可以在2至3周內(nèi)觀察SCALEVIEW-S透明化的樣品中的

Ａ：熒光信號。

Ａ：CUBIC處理的樣品應在室溫下保存1周。您可以在1周內(nèi)觀察CUBIC透明化的樣品中的熒光信號。

Ａ：SeeDB2G處理的樣品應在冰箱中保存1年，而SeeDB2S處理的樣品則可在室溫下保存1年。您可以在1年內(nèi)觀

Ａ：察SeeDB透明化的樣品中的熒光信號。

 

Q：抗體的熒光標記

Ａ：應在進行透明化前就進行抗體的熒光標記。

 

Q：適用于SCALEVIEW-S的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：適用于CUBIC的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：適用于SeeDB2的顯微鏡

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸鏡頭）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用復合浸沒鏡頭）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸鏡頭）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制鏡面的設備）

 

Q：重構

Ａ：對于定量用途，我們建議使用Neurolucida系統(tǒng)（MBF）。我們同樣測試了VAST Lite用于成像用途時的表

Ａ：現(xiàn)。重構時也可以使用開源軟件。例如，Vaa3d可以處理大量的拼接圖像的數(shù)據(jù)。

 

Q：物鏡推薦

 

Q：其他物種？其他器官？

Ａ：對于昆蟲樣品和魚類樣品，建議選擇CUBIC。

Ａ：昆蟲相關文獻：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：魚類相關文獻：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　對于多細胞球狀體，選擇SCALEVIEW-S會更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

參考文獻

[1]	Hama,H.et al.:ProtocolExchange（2016).doi:10.1038 /protex.2016.019.
[2]	Hama,H.et al.:Nat.Neurosci.,18,1518(2015).
[3]	濱裕、日置寛之、並木香奈、星田哲志、黒川裕、宮脇敦史：生體の科學，68（1），85（2017）.
[4]	日置寛之、濱裕、孫在隣、黃晶媛、並木香奈、星田哲志、黒川裕、宮脇敦史：日本薬理學雑誌， 149 （4），173（2017）.