SeeDB

實(shí)現(xiàn)生物體樣本深層成像

　　今井猛博士等人開發(fā)了一種對于水溶性生物體組織的形態(tài)和組成在不破壞熒光蛋白以及熒光神經(jīng)同位素的條件下,可快捷簡便地使大腦等生物體組織透明化的方法——SeeDB（See Deep Brain）。SeeDB由水、果糖、還原劑構(gòu)成。

　　SeeDB法是在使用共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)顯微鏡下可深層成像的方法?？衫脽晒獾鞍缀蜕窠?jīng)示蹤劑，實(shí)現(xiàn)對熒光神經(jīng)回路的全貌闡明和定量分析等各種各樣的應(yīng)用。

詳細(xì)內(nèi)容，請點(diǎn)擊SeeDB技術(shù)開發(fā)者今井猛博士的網(wǎng)站：SeeDB Resources（本部分內(nèi)容亦可參見相關(guān)資料）

◆SeeDB protocol案例

　　SeeDB法，可用于脊椎動物的各種組織，下面以小鼠大腦為例進(jìn)行介紹。

１．固定

①　將小鼠大腦在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定過夜。

②　樣本用PBS清洗三次（每次清洗10分鐘）

２．透明化處理

③　將樣品加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL錐形瓶中。

　　在室溫下在旋轉(zhuǎn)器中旋轉(zhuǎn)4-8小時（約4 rpm）

　　在脆弱的樣本和薄片情況也可以用壓板式搖床（約17 rpm）

④　將樣本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。

⑤　將樣本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。

⑥　將樣本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。

⑦　將樣本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。

⑧　將樣本加入放有SeeDB的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)24小時。

   　最長時間可延長至48小時。在透明化成功時，透光可觀察到組織透明化。

３．觀察

⑨　將SeeDB處理過的大腦樣本置于共聚焦顯微鏡或雙光子激發(fā)顯微鏡下觀察。

（注意點(diǎn)）

　　樣本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化處理后的樣本折射率可達(dá)到1.49。因此，物鏡中應(yīng)該有甘油浸沒透鏡、油鏡、透明化用鏡片，即使浸水鏡頭到達(dá)2 mm深度也是沒有問題的。浸沒式鏡片請使用浸沒液，SeeDB不能用作浸沒液。在使用干式鏡頭（折射率1.0）和浸水鏡頭（折射率1.33）獲取畫像情況下，需要補(bǔ)正深度值（補(bǔ)正值請參考相關(guān)文獻(xiàn)）。

 

SeeDB　處理案例

SeeDB生物體樣本透明化

左起依次為經(jīng)SeeDB液透明化處理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全腦、成鼠大腦（8周齡，厚度2 mm）

SeeDB　觀察案例

雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周齡）大腦熒光成像 使用Olympus公司產(chǎn)品  多光子專用物鏡：XLPLN10XSVMP觀察案例	共聚焦顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周齡）大腦熒光成像 使用Olympus公司產(chǎn)品 有機(jī)硅浸沒式物鏡：UPLSAPO 10X2觀察案例

雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周齡）大腦熒光成像

使用Olimpus公司產(chǎn)品

多光子專用物鏡：XLSLPLN25XGMP觀察案例

比例尺：100 μm

小鼠大腦固定后用Dil標(biāo)記，SeeDB透明化處理案例   

左：嗅球僧帽細(xì)胞樹突（橫向觀察）

右：嗅球僧帽細(xì)胞樹突（縱向觀察）

使用Olympus公司產(chǎn)品

有機(jī)硅浸沒型物鏡：UPLSAPO 20X觀察案例。比例尺：100 μm。

組織透明化配套耗材：成像用透明室

透明化試劑方法選擇流程.pdf

組織透明化試劑Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：組織透明化的原則

Ａ：組織透明化通常是按下面的步驟進(jìn)行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脫色 （d）折射率匹配

 

Q：組織透明化的優(yōu)勢

Ａ：目前大多數(shù)可用的透明化技術(shù)，都是通過編碼熒光報告蛋白或者用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行后標(biāo)記，從而可視化

Ａ：組織中特定的蛋白。組織透明化成為了具有單細(xì)胞分辨率的組織3D成像中重要的一環(huán)。

 

Q：透明化技術(shù)的比較

Ａ：下面是水性的透明化技術(shù)。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些應(yīng)用中有一定優(yōu)勢。因為SeeDB不含去垢劑，所以對于透明化DiI(細(xì)胞膜

Ａ：紅色熒光探針，一種神經(jīng)示蹤劑)標(biāo)記的樣品和使用光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（CLEM）的情況下，SeeDB有著一定優(yōu)

Ａ：勢。另外SeeDB會產(chǎn)生自體熒光，有時候會對辨認(rèn)未標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)氈）起著一定幫助。

Ａ：SeeDB2是為使用高NA物鏡的高分辨率成像而優(yōu)化的技術(shù)；因此，當(dāng)處理較大的組織時，CLARITY或者CUBIC

Ａ：會是更好的選擇。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您應(yīng)該根據(jù)您的物鏡的WD（工作距離）來決定切片的厚度。我們建議切片的厚度不要超過3mm。對于十分薄

Ａ：且脆弱的樣品，我們建議使用瓊脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以讓全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重復(fù)性。

 

Q：試劑盒成分

Ａ：具體如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S試劑盒（299-79001）適用于20份1-2mm的切片樣品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S試劑盒（290-80801）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB試劑盒（299-79901）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2試劑盒（294-80701）適用于20-30份1-2mm的切片樣品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：樣品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S處理的樣品應(yīng)在室溫下保存2至3周。您可以在2至3周內(nèi)觀察SCALEVIEW-S透明化的樣品中的

Ａ：熒光信號。

Ａ：CUBIC處理的樣品應(yīng)在室溫下保存1周。您可以在1周內(nèi)觀察CUBIC透明化的樣品中的熒光信號。

Ａ：SeeDB2G處理的樣品應(yīng)在冰箱中保存1年，而SeeDB2S處理的樣品則可在室溫下保存1年。您可以在1年內(nèi)觀

Ａ：察SeeDB透明化的樣品中的熒光信號。

 

Q：抗體的熒光標(biāo)記

Ａ：應(yīng)在進(jìn)行透明化前就進(jìn)行抗體的熒光標(biāo)記。

 

Q：適用于SCALEVIEW-S的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：適用于CUBIC的顯微鏡

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：適用于SeeDB2的顯微鏡

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸鏡頭）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用復(fù)合浸沒鏡頭）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸鏡頭）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制鏡面的設(shè)備）

 

Q：重構(gòu)

Ａ：對于定量用途，我們建議使用Neurolucida系統(tǒng)（MBF）。我們同樣測試了VAST Lite用于成像用途時的表

Ａ：現(xiàn)。重構(gòu)時也可以使用開源軟件。例如，Vaa3d可以處理大量的拼接圖像的數(shù)據(jù)。

 

Q：物鏡推薦

 

Q：其他物種？其他器官？

Ａ：對于昆蟲樣品和魚類樣品，建議選擇CUBIC。

Ａ：昆蟲相關(guān)文獻(xiàn)：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：魚類相關(guān)文獻(xiàn)：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　對于多細(xì)胞球狀體，選擇SCALEVIEW-S會更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

參考文獻(xiàn)：

[1]　Ke, M. T., Fujimoto, S. and Imai, T. : Nat Neurosci ,6 (8),1154 (2013).

[2]　Ke, M. T., Fujimoto, S. and Imai, T.: Bio-protocol ,4(3), e1042 (2014).

[3]　Ke, M. T., and Imai, T. : Curr Protoc Neurosci ,66, 2.22.1-2.22.19 (2014).