Allophycocyanin Labeling Kit – SH

08 ラベル化剤

Allophycocyanin Labeling Kit – SH

• ラベル化剤
• FCM
• 50-200?
• SH

抗體?タンパク質(zhì)標(biāo)識(shí)キット

• アミノ基でうまくいかなかった
• 蛍光色素より高感度でみたい

• 製品コード
  LK24　 Allophycocyanin Labeling Kit – SH

• ご購(gòu)入方法
• お問(wèn)い合わせ

マニュアル

Q

Labeling Kitで1次抗體を直接標(biāo)識(shí)する利點(diǎn)を教えてください。

A

はじめて抗體標(biāo)識(shí)をされる方を?qū)澫螭趣筏骏抓恁去偿毪蜃鞒嗓筏皮辘蓼埂?nbsp;
カスタマーサポートの視點(diǎn)から直接標(biāo)識(shí)法の利點(diǎn)や実施例等を記載しておりますので、ご參照下さい。 

下記リンクよりダウンロード可能です。

「はじめての抗體標(biāo)識(shí)プロトコル　～カスタマーサポートの視點(diǎn)から～」
 

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

A

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質(zhì)が含まれるかを確認(rèn)の上、狀況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標(biāo)識(shí)反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1萬(wàn)以上＞
影響する可能性があります。
高分子でSH基をもつ化合物は、Filtration Tubeでも除くことができません。 そのため標(biāo)識(shí)され、蛍光性不純物として影響します。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。 一方、SH基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標(biāo)識(shí)?精製操作に支障がでる可能性もあります。
＊本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗體の精製について、小社抗體精製キット（下記）を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A　　　IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code：AP01もしくはAP02)

市販の抗體 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書(shū)に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ（Collagenase）によるゼラチン分解

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: ゼラチン含有IgG溶液 2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬 ?コラーゲナーゼ（Sigma, #C7826） 3.5 CDU/ml 希釈溶液 ?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ?市販の抗體 200 μg (2)精製方法 ?0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調(diào)製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。 ?37℃、3時(shí)間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※IgG Purification Kitでは、抗體を固定化擔(dān)體に保持させる際の抗體溶液量を一回當(dāng)たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗體溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを擔(dān)體に保持させる操作を8回（200 μl×7, 100 μl×1）に分けて行う。 ※上記の方法で得られる抗體の回収率：45～50%

B. 300K 限外ろ過(guò)チューブを用いたゼラチン除去

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: IgG 2: ゼラチン含有IgG溶液 3: 300K限外濾過(guò)のみのIgG溶液 4: 300K限外濾過(guò)+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬 ?300K フィルトレーションチューブ（Pall社 ナノセップ遠(yuǎn)心ろ過(guò)デバイス（製品コード：OD300C33） ?IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ?市販の抗體 200 μg (2)精製方法 ?0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過(guò)を行う（200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g）。 ?その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸著操作は5回繰り返す。 ※上記の方法で得られる抗體の回収率：35～45%

 

Q

サンプルは溶液になっていても問(wèn)題ないでしょうか？

A

溶液になっていること自體は問(wèn)題ありません。
ただし、下記の點(diǎn)をご確認(rèn)いただいた上でご使用ください。
-濃度-
　サンプル濃度が0.5 mg/ml以下(50 μg/100 μl以下)である場(chǎng)合には
　Filtration tubeを用いてサンプル量が50～200 μgとなるように
　遠(yuǎn)心して濃縮を行ってください。
　フィルター上に殘ったサンプルは再溶解させる必要はありません。
　そのまま反応にご使用ください。

-溶液量-
　Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100 μl以下でご使用ください。

-共存物-
　?不溶性の低分子が含まれる場(chǎng)合は、予め遠(yuǎn)心して上清のみを使用してください。
　?分子量10,000以上の物質(zhì)が含まれる場(chǎng)合には、別途精製を行ってからご使用ください。
　　(市販の抗體の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場(chǎng)合があります）

Q

低分子の蛍光色素と比較して、蛍光タンパク色素を標(biāo)識(shí)するメリットは何でしょうか？

A

以下のような點(diǎn)が挙げられます。

?1分子あたりの蛍光強(qiáng)度が大きいので、IgGに1分子の蛍光タンパクが標(biāo)識(shí)された場(chǎng)合、
　Fluoresceinなどの數(shù)倍の蛍光強(qiáng)度が得られます。

?勵(lì)起スペクトルの吸収域が広いので、極大を外れた波長(zhǎng)でも勵(lì)起できます。
?。ǚ鶐冥?lì)起フィルターが活用できます)

Q

低分子のタンパク質(zhì)（分子量50,000以下）に標(biāo)識(shí)する場(chǎng)合の方法を教えて下さい。

A

キット付屬のフィルトレーションチューブは分畫(huà)分子量30Kの限外濾過(guò)フィルターのため、

余裕をもって50,000以上のタンパク質(zhì)のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質(zhì)を標(biāo)識(shí)される場(chǎng)合は、

下記のような分畫(huà)分子量の小さい限外濾過(guò)フィルターに変更して

頂くことで、低分子のタンパク質(zhì)でもラベル化可能でございます。

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PALL社　ナノセップ　 3K　製品No.OD003C33
PALL社　ナノセップ　10K　製品No.OD010C33 
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キット同梱のフィルターを用いた場(chǎng)合に比べ遠(yuǎn)心に時(shí)間を要することが

ございますので遠(yuǎn)心時(shí)間はご検討下さい。

Q

蛍光タンパクが3種類ありますが、それぞれの波長(zhǎng)特性を教えてください。

A

Allophecocyanin(略：APC)　勵(lì)起波長(zhǎng)：650nm 蛍光波長(zhǎng)：660nm

B-Phycoerythrin(略：B-PE) 勵(lì)起波長(zhǎng)：564nm 蛍光波長(zhǎng)：575nm

R-Phycoerythrin(略：R-PE) 勵(lì)起波長(zhǎng)：564nm 蛍光波長(zhǎng)：575nm

Q

標(biāo)識(shí)率は出せますか？

A

標(biāo)識(shí)後のサンプル溶液には、未反応のReactive體が含まれるため標(biāo)識(shí)率を算出することはできません。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。