Lipi-Blue

05 細(xì)胞染色用色素

Lipi-Blue

• 細(xì)胞染色用色素
• 細(xì)胞機(jī)能解析

脂肪滴染色蛍光色素

• 製品コード
  LD01　 Lipi-Blue

 ※ 35 mm dish: 10 ～ 50 枚分

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マニュアル

Q

オレイン酸溶液の調(diào)製方法と細(xì)胞への導(dǎo)入方法を教えてください。

A

小社では以下の手順でオレイン酸溶液を調(diào)製して使用しました。

<オレイン酸ストック溶液>
必要な試薬
　?BSA (ウシ血清アルブミン)
　?オレイン酸
　?0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)

調(diào)製手順
1）	0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)にBSAを添加し溶解する(BSA: 濃度 0.14 g/mL)。
2）	容器（ディスポーザブルの遠(yuǎn)沈管など）にオレイン酸を入れた後、１）のBSA溶液を加えて回転振盪器を用いて混合する（オレイン酸濃度: 4 mmol/L）。*1
3）	2）の混合溶液を、ポアサイズが0.22 µmのシリンジフィルター（PTFE製)でろ過する。
4）	冷蔵保存して、都度、使用する。*2
	*1オレイン酸とBSA溶液を混合すると液體中に曇りを生じる場合がありますが、振盪を続けるとオレイン酸 とBSAの複合體が形成され曇りが消失します。 *2実験で用いる培地にオレイン酸ストック溶液を必要量を添加して、細(xì)胞へのオレイン酸導(dǎo)入に使用してください。
<細(xì)胞への導(dǎo)入方法>
1）	細(xì)胞を 5% CO2インキュベーター（37℃）內(nèi)で、24時(shí)間培養(yǎng)する。
2）	オレイン酸ストック溶液を添加した培地（オレイン酸の終濃度 200 μmol/L）に置換して、更に、24時(shí)間培養(yǎng)する。
3）	その後、取扱説明書に従って、脂肪滴を蛍光染色して観察する。

 

Q

共染色時(shí)の推奨フィルターを教えてください。

A

ご使用の色素と勵(lì)起波長に応じて、下記表を參照のうえ共染色に適したフィルターを選択ください。

勵(lì)起波長 （共染色色素）	405 nm （Hoechst, DAPI etc.）	488 nm （FITC, GFP etc.）	561 nm （Cy3, Rhodamine, RFP etc.）	633 nm （Cy5, mCherry etc.）
Lipi-Blue	Lipi-Blueの蛍光観察	Lipi-Blueは488 nm, 561 nmおよび633 nmでは勵(lì)起されません。 そのため何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。
Lipi-Green	Lipi-Greenは405 nmで若干勵(lì)起されます。 Lipi-Greenの蛍光漏れ込みを抑えるため、400-500 nmの範(fàn)囲內(nèi)の蛍光フィルターをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/span>	Lipi-Greenの蛍光観察	Lipi-Greenは561 nmおよび633 nmでは勵(lì)起されません。 そのため、何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。
Lipi-Red	Lipi-Redは405 nmで若干勵(lì)起されます。 Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、400-500 nmの範(fàn)囲內(nèi)の蛍光フィルターをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/span>	Lipi-Redは488 nmで若干勵(lì)起されます。 Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、500-550 nmの範(fàn)囲內(nèi)の蛍光フィルターをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/span>	Lipi-Redの蛍光観察	Lipi-Redは633 nmで若干勵(lì)起されます。 Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、650-700 nmの範(fàn)囲內(nèi)の蛍光フィルターをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/span>
Lipi-Deep Red	Lipi-Deep Redは、405および488 nmでは勵(lì)起されません。 そのため何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。		Lipi-Deep Redは561 nmで若干勵(lì)起されます。 Lipi-Deep Red由來の蛍光漏れ込みを抑えるため、560-610 nmの範(fàn)囲內(nèi)の蛍光フィルターをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/span>	Lipi-Deep Redの蛍光観察

 

Q

蛍光が確認(rèn)できない場合の対処法は？

A

蛍光が検出されない場合、幾つか要因が考えられます。
下記に示した項(xiàng)目を確認(rèn)し、狀況によっては最適化條件をご検討ください。

①勵(lì)起?蛍光波長が色素の蛍光特性と合致していない。
製品HPに掲載の色素の蛍光スペクトルとお使いのフィルターを確認(rèn)し、勵(lì)起?蛍光波長が
合致しているかご確認(rèn)ください。

②染色條件が最適ではない。
[試薬濃度]
– working solutionの濃度を下記の範(fàn)囲で検討する。
Lipi-Blue, Lipi-Green：0.1-0.5 μmol/L
Lipi-Red：1-5 μmol/L

※上記條件でも蛍光が検出されない場合、更に高濃度で染色する。
Lipi-Blue, Lipi-Green：1-2 μmol/L
Lipi-Red：10-20 μmol/L

[インキュベーション時(shí)間]
– 通常は30分ですが、試薬添加後に1-2時(shí)間インキュベートする。

③固定化の條件が適していない。
細(xì)胞によっては染色前後の固定化操作により、染色されない又は感度が弱くなる場合があります。
その際は、「Q:固定化細(xì)胞への染色は可能ですか？」をご參照ください。

④脂肪滴が小さくて確認(rèn)が困難。
細(xì)胞によっては脂肪滴が小さく、確認(rèn)が困難な場合があります。
その際は、高倍率の顕微鏡での確認(rèn)、又はオレイン酸処理した細(xì)胞によるポジティブコントロールを
評(píng)価されることをお?jiǎng)幛幛筏蓼埂?/p>

Q

固定化細(xì)胞への染色は可能ですか？

A

固定化した細(xì)胞でも染色は可能です。固定化細(xì)胞の染色手順は、下記を參照ください。
※固定化処理にはパラホルムアルデヒド(PFA)をご使用ください。メタノール等のアルコール固定は、脂肪滴の構(gòu)造に影響を及ぼす可能性があるため、お?jiǎng)幛幛筏蓼护蟆?br /> ※細(xì)胞によっては、染色前後の固定化操作により、染色されない又は感度が弱くなる場合があります。その際は、固定化條件を検討頂く必要があります。

○染色後に細(xì)胞を固定化した例?。紝g績細(xì)胞 : HepG2細(xì)胞＞
①培地を除去し、PBSで二回洗浄した。
②プロトコル記載のWorking solution(in PBS)を細(xì)胞に入れ、37℃で15分インキュベートした。
③上清を除去し、PBSで二回洗浄した。
④4% PFA (in PBS)で5分間室溫でインキュベートした。
⑤上清を除去し、PBSで洗浄後、観察。

○染色前に細(xì)胞を固定化した例?。紝g績細(xì)胞 : HeLa細(xì)胞＞
①培地を除去し、PBSで二回洗浄した。
②4% PFA (in PBS)で5分間室溫でインキュベートした。
③上清を除去し、PBSで二回洗浄した。
④プロトコル記載のWorking solution(in PBS)を細(xì)胞に入れ、37℃で30分インキュベートした。
⑤上清を除去し、PBSで洗浄後、観察。

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