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◆原理

　　在工業(yè)生產(chǎn)的疫苗和治療用生物制品（干擾素、白細胞介素、單克隆抗體、重組蛋白）中，宿主細胞殘余DNA 污染直接影響最終產(chǎn)品和整個生產(chǎn)過程的質(zhì)量和產(chǎn)量，可能引起動物致瘤、感染病毒DNA 等嚴重后果， 中國藥典、WHO、EU、FDA對宿主細胞DNA 殘留限量都有規(guī)定。傳統(tǒng)的DNA 提取方法蛋白酶K-SDS 法在SDS的穩(wěn)定和促進下降解細胞中的蛋白質(zhì)特別是核酶，再經(jīng)有機溶劑萃取得到高質(zhì)量的DNA，但有提取時間較長和使用有毒溶劑氯仿和苯酚等缺點。該產(chǎn)品是血清中病毒DNA 和生物制品宿主細胞殘余DNA 的提取試劑盒。使用新型提取步驟，用碘化鈉（NaI）作為促溶劑，穩(wěn)定且靈敏度高、時間短，無有毒溶劑，無需復(fù)雜和費力操作，即可從樣品中得到高質(zhì)量和高回收率的DNA。

 

 

◆特點

●　可與Threshold 系統(tǒng)配合使用進行DNA 定量分析

●　高靈敏度，可提取低至10 pg 的DNA

●　單獨的離心管無交叉污染，提取的DNA可用于下游實驗

●　可獲得高質(zhì)量高回收率的DNA

注： 和光純藥公司引進并銷售美國Molecular Devices公司（加利福尼亞州門洛帕克）開發(fā)的檢測DNA用

注： 的生物傳感器（Threshold Systems）。“Threshold”是檢測微量的DNA分子系統(tǒng)。

 

試劑盒組成

試劑盒組成（50 次反應(yīng)）：

1.　碘化鈉溶液 1×26 mL

2.　月桂酰肌氨酸鈉溶液 1×1.2 mL

3.　洗滌液（A） 1×42 mL

4.　洗滌液（B） 2×40 mL

5.　糖原溶液 1×0.1 mL

 

 

Wako DNA 提取試劑盒產(chǎn)品選擇

樣品	全血	血清	血漿	組織	石蠟包埋 組織切片	生物制藥	培養(yǎng)細胞	頭發(fā)、指甲 血跡、唾液
	?   DNA Extractor? WB Kit				?   DNA Isolator PS Kit
基因組 DNA	?   DNA Extractor? WB-Rapid   Kit			?   DNA Extractor? WB Kit	?   DNA Isolator PS-Rapid   Reagent		?   DNA Extractor? WB Kit	?   DNA Extractor? FM Kit
線粒體 DNA (mtDNA)	?   mtDNA Extractor? WB Kit			?   mtDNA Extractor? CT Kit			?   mtDNA Extractor? CT Kit
游離 DNA		?   DNA Extractor? SP Kit	?   DNA Extractor? SP Kit
低氧化程度的 DNA	?   DNA Extractor? WB Kit			?   DNA Extractor? TIS Kit			?   DNA Extractor? TIS Kit
細菌基因組 DNA		?   DNA Extractor? Kit				?   DNA Extractor? Kit

  

 

 ◆案例?應(yīng)用

DNA Extractor^? Kit在生物制藥中DNA殘留檢測的應(yīng)用

DNA  Extractor^? Kit說明書       No.295-50201

 

說明書	DNA 提取試劑盒PDF

　　本產(chǎn)品是血清中含有的病毒DNA 和生物制品宿主細胞殘余DNA 的提取試劑盒, 無有毒溶劑、提取時間短、DNA 提取純度高、DNA 回收率高。

 

◆DNA 抽提原理

　　高濃度的促溶劑碘化鈉和陰離子去垢劑參與生物制品中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的溶解，然后在混合物中加入異丙醇，糖原和核酸共沉淀可作為載體，而碘化鈉和陰離子去垢劑阻止樣品中蛋白等成分的沉淀使其溶于液相，從而選擇性沉淀DNA。

 

◆試劑

1．　試劑盒組分： 1）　碘化鈉溶液 1×26 mL 2）　月桂酰肌氨酸鈉 1×1.2 mL 3）　洗滌溶液（A） 1×42 mL 4）　洗滌溶液（B） 2×40 mL 5）　糖原溶液 1×0.1 mL

2．必需的試劑和儀器： 試劑： 1）　異丙醇（特級） 40 mL 試劑： 2）　蒸餾去離子水 6 mL 儀器： 1）　微型離心機（Max. 12,000 g） 儀器：2）　有蓋微量離心管（1.5 or 2 mL） 儀器：3）　旋渦混合器

 

 

◆保存

　　2 – 10℃，試劑盒的保存期為2 – 3 年。

 

◆DNA Extractor^? 系列產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	樣品類型	原理	特點	試劑盒組成
生物制品中的殘余 DNA 提取
295-50201	DNA   Extractor? Kit Wako	50 次	生物制藥血清	碘化鈉法	生物制品中的殘余 DNA 提取	碘化鈉溶液 月桂酰肌氨酸鈉溶液 洗滌液 (A) 洗滌液 (B) 糖原溶液	1×26 mL 1×1.2 mL 1×42 mL 2×40 mL 1×0.1 mL
血清和血漿中的 DNA 提取
296-60501	DNA Extractor?  SP Kit	50 次	血清和血漿	碘化鈉法	1. 高靈敏度僅需 100 μl 血清或血 漿樣品，高 DNA 產(chǎn)量； 2.  整個提取過程在單獨的離心管中，無交叉污染； 3. 特別配制的乙醇能完全去除血液 中的脂質(zhì)。	酶反應(yīng)液 蛋白質(zhì)消化液 碘化鈉溶液  乙醇溶液 洗滌液 (A) 洗滌液 (B)	1×10 mL 1×250 μL 1×15 mL 1×30 mL 1×50 mL 1×50 mL
人和動物組織中的 DNA 提?。ㄓ糜?8- 羥基脫氧鳥苷檢測）
296-67701	DNA Extractor?  TIS Kit	50 次	組織培養(yǎng)細胞	碘化鈉法	1.   用于 8- 羥基脫氧鳥苷（氧化應(yīng)激標(biāo)志物）檢測和鑒定 2.   抗氧化劑阻止更進一步的 DNA氧化。	裂解液 酶反應(yīng)液 蛋白酶溶液 蛋白消化液  氧化抑制劑 碘化鈉溶液 乙醇溶液 PEG 溶液	2×75 mL 1×15 mL 1×50 μL 1×750 μL 1×350 μL 1×15 mL 1×30 mL 1×20 mL
全血中的 DNA 提取
291-50502	DNA   Extractor?  WB Kit	50 次	全血組織培養(yǎng)細胞	碘鈉化法	1.   高 DNA 回收率 2. 整個提取過程在單獨的離心管 中，無交叉污染；	裂解液 酶反應(yīng)液 碘化鈉溶液 洗滌液 (A) 洗滌液 (B) 蛋白酶	2×65 mL 1×10 mL 1×15 mL 1×50 mL 1×50 mL 1×10 mg
297-54801 293-54803	DNA Extractor?  WB-Rapid Kit	20 次 200 次	全血		比 DNA Extractor? WB Kit 實驗步驟更少、提取時間更短                  (30 分鐘以內(nèi) )	裂解液 酶反應(yīng)液 洗滌液   蛋白酶溶液	20 次反應(yīng) 1×10 mL 1×0.8 mL 1×20 mL 1×40 μL	200 次反應(yīng) 2×50 mL 1×8 mL 3×70 mL 1×400 μL
石蠟包埋組織的 DNA 提取
295-52401	DNA Isolator PS Kit	100 次	石蠟包埋組織			酶反應(yīng)液 酶激活劑 蛋白酶 DNA 沉淀促進劑 DNA 稀釋劑	1×2 mL 1×34 mg 1×2.2 mg 1×0.5 mL 1×0.5 mL
291-56401	DNA Isolator PS-Rapid Reagent	100 次	石蠟包埋組織	煮沸法		DNA 提取溶液	5×10 mL
全血中線粒體 DNA 提取
293-54401	mtDNA   Extractor?  WB Kit	25 次	全血	碘化鈉法	全血中線粒體 DNA 提取可在 90 分 鐘內(nèi)完成。	白血球提取溶液 DNA 提取溶液 I DNA 提取溶液 II(A) DNA 提取溶液II(B) DNA 提取溶液 III 碘化鈉溶液 洗滌液	1×5.0 mL 1×26.5 mL 1×1.3 mL 1×1.3 mL 1×1.9 mL 1×7.5 mL 1×50 mL
培養(yǎng)細胞和組織樣品中的線粒體 DNA 提取
291-55301	mtDNA   Extractor?  CT Kit	25 次	組織培養(yǎng)細胞	碘化鈉法	培養(yǎng)細胞和組織樣品中的線粒體 DNA 提取	勻漿液緩沖液 DNA 提取溶液 I DNA 提取溶液 II(A) DNA 提取溶液II(B) DNA 提取溶液 III 碘化鈉溶液 洗滌液	1×25.0 mL 1×1.3 mL 1×1.3 mL 1×1.3 mL 1×1.9 mL 1×7.5 mL 1×50 mL
法醫(yī)學(xué)調(diào)查的 DNA 提取
295-58501	DNA Extractor?  FM Kit	50 次	頭發(fā)  指甲  血跡  唾液	碘化鈉法	在幾十分鐘內(nèi)可溶解多種毛發(fā)	裂解液 酶激活試劑 (EAR) 再水化液 蛋白酶 碘化鈉溶液   洗滌液 (A) 洗滌液 (B)	1×9.5 mL 1×80 mg 1×0.5 mL 1×10 mg 1×12.5 mL 1×50 mL 1×50 mL

Q：    產(chǎn)品的特色是什么？
A：    傳統(tǒng)的方式是采用蛋白酶 -SDS 的方法提取 DNA，雖然能夠獲得高品質(zhì)的 DNA，但是后續(xù)需 要用苯酚 –

         氯仿進行處理，而苯酚 – 氯仿屬于危險化學(xué)品，對人體有一定危害。Wako 的該試劑盒采用碘化鈉法，能獲

         得高質(zhì)量和高回收率的 DNA，抽提過程不需要使用苯酚 – 氯仿。碘化鈉代替苯酚 – 氯仿，溶解蛋白和脂類。

         糖原作為載體，異丙醇沉淀DNA。只需將 試劑加入離心管內(nèi)即可，不同于其他的 DNA 抽提試劑盒采用柱吸

         附法。

Q：    測定原理
A：    碘化鈉是離液序列離子的代表化合物，可作為蛋白質(zhì)的溶解劑使用。月桂基?；彼徕c是和 SDS 相同的表面

          活性劑，蛋白質(zhì)的改性劑。 由這兩個化合物作用使蛋白質(zhì)改性后與核酸分離。蛋白質(zhì)的改性、溶解（核酸也

          是溶解狀態(tài)）的狀態(tài)中添加酒精（異丙醇），使核酸析出，沉淀。

Q：    產(chǎn)品說明書中的方法 1 是血清中提取 DNA，請問血漿是否可用？
A：    血漿可以用。

Q：    產(chǎn)品回收率多少？
A：    一般，樣品中提取殘留 DNA，即使極微量（DNA 在 10 pg 左右）也能高效率的回收而不傷害樣品。文獻 *

         報道的回收率是 80% ~ 90%

Q：    該產(chǎn)品說明書上提供了兩種方法，該如何選擇？
A：
          方法 1 是用于血清 DNA 的抽提，如果樣品蛋白濃度高可以采用這種方法。
          方法 2 是 Threshold Systems 總 DNA 檢測時樣品的處理，是配套 Molecμlar Devices的生物制品中定量

          DNA 和蛋白的光尋導(dǎo)電位傳感器（LAPS）使用。在其說明書上有介紹Wako 該款試劑盒的操作步驟。如果

          樣品蛋白濃度低，也可以采用方法 2。MolecμlarDevices 說明書上的步驟，和 Wako 該款試劑盒的操作步

          驟略有差異，客戶可依據(jù)具體情況而定。

          注：和光純藥公司引進并銷售美國Molecular Devices公司（加利福尼亞州門洛帕克）開發(fā)的檢測DNA用的

          注：生物傳感器（Threshold Systems）?！癟hreshold”是檢測微量的DNA分子系統(tǒng)。

Q：    什么樣的樣品可使用該款試劑盒？  
A：    檢測生物蛋白類藥物包括抗體，疫苗和治療性蛋白中殘留的 DNA。這些生物制藥可能是由細菌，酵母，動

          物或者細胞系生產(chǎn)獲得。殘留的宿主細胞 DNA 即使是小劑量，也會引起藥物安全性 問題，所以 FDA 和

          WHO 對生物蛋白類藥物中殘留的宿主 DNA 都有規(guī)定。

Q：    是否可以用蛋白酶 K（Proteinase K）裂解細胞？
A：    推薦用蛋白酶 K 先處理樣品，可提高回收率。Protein K 本身不含有 DNA。

Q：    客戶使用該試劑盒前用蛋白酶 K 消化樣品蛋白，但是回收率沒有達到文獻 * 提到 80 ~ 90%。
A：    蛋白酶 K 消化蛋白滅活核酸酶的過程可能導(dǎo)致純化過程中 DNA 降解。建議 37 ℃（或 60 ℃過夜），添加

          SDS 裂解緩沖液。（MD 的操作是加入蛋白酶 K 和 SDS 溶液，55℃過夜）注意：PK 處理的后期 SDS 濃

          度不能超過 0.1%。在處理的末期，SDS 可能減少 1/10。裂解緩沖液開始不能超過 1% SDS。

Q：    是否可以用乙醇替代異丙醇？
A：    用乙醇替代異丙醇，可能會導(dǎo)致回收率下降。若要使用乙醇，客戶可嘗試自己優(yōu)化條件。

Q：    按照方法 2，樣品的體積是 400 μl 或者 500 μl，如果添加蛋白酶 K，樣品的體積應(yīng)該是多少？
A：    添加蛋白酶 K 以及緩沖液的，包括蛋白酶 K 和緩沖液在內(nèi)樣品的體積是 400 μl 或者 500 μl。

Q：    按照方法 2，樣品體積要求 400 μl，但是如果達不到 400 μl，可否用 200 μl 或者 250 μl 樣品做實驗？
A：    樣品體積是 200 μl 或者 250 μl，也可以做實驗。所有試劑按照相應(yīng)比例添加。

Q：    方法 1 中，26 ml NaI 溶液中加入 6 ml 蒸餾水稀釋，再加入 1 ml 月桂酰肌氨酸鈉和 65μl 糖原混合后，

          可以保存多久？
A：    大約半年。

Q：    能否用熒光法進行檢測？
A：    可以。使用者需要考慮熒光法檢測的范圍。（比如 EB 染色）

Q：    得到的 DNA 是否可進行 Real-Time PCR ？
A：    可以。

Q：    樣品是蛋白。最后一步沉淀離心時，離下來的沉淀經(jīng)常不牢，沉淀會飄起來，使后續(xù)不易操作。
A：    可嘗試將方法 2 中提取步驟 8 的離心分離的條件從"10,000 g x 5 mins"增加到"10,000 gx 10 mins"。
          步驟 8 加入洗滌溶液 B 后的渦旋盡量時間短點。過分渦旋會導(dǎo)致回收率下降。另外， 步驟 5 的殘留

          溶液請去除干凈完全。

Q：    DNA 的回收率低。
A：    可嘗試不做渦旋，輕柔的傾倒試管混合，盡量不破壞 Pellet 的形狀。

Q：    如果客戶樣品中蛋白含量高，采用說明書中的哪個方法？
A：    1）預(yù)處理樣品：樣品中加入 2 mg/ml 蛋白酶 K 和 1% SDS，37℃或者 60℃過夜。
          2）按照方法 1 進行。添加糖原溶液（可以是說明書上提到的   2 倍體積）有助于 DNA 沉淀。