愈創(chuàng)木酚檢測(cè)試劑盒

Guaiacol Detection Kit

◆背景

 

嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidoterrestris是革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)芽胞厭氧菌，在自然界中普遍存在。1984年透明蘋果汁混濁事件后該物種被大量研究。生長(zhǎng)在相對(duì)高的溫度和酸性條件下的Alicyclobacillus類細(xì)菌，稱為熱-嗜酸性桿菌（TAB） [1, 2, 3].

TAB不能通過(guò)巴氏消毒法被滅菌，可能殘留在合成的食物和飲料中。尚不清楚TAB是否對(duì)人體有害，但產(chǎn)生有異味的愈創(chuàng)木酚，會(huì)降解果汁和其他產(chǎn)品的質(zhì)量。即使沒(méi)有異味，在分配過(guò)程中輕微惡化引起的降解也會(huì)降低產(chǎn)品的質(zhì)量。                                                                                                                               Va-YSG Medium  

避免TAB污染是非常困難的，特別是在土壤中。幸運(yùn)的是，引起污染的   

A. acidocaldarius 和其他主要物種被認(rèn)為是無(wú)害的，TAB引起的損害能夠通

過(guò)監(jiān)測(cè)被認(rèn)為有害的A. acidoterrestri來(lái)縮小。因?yàn)檫@些物種生長(zhǎng)相對(duì)高溫

和酸性的條件下，不能通過(guò)常規(guī)的提取培養(yǎng)的方式進(jìn)行檢測(cè)。                 

由于歐洲和其他區(qū)域經(jīng)常發(fā)生果汁質(zhì)變事件，2003年3月日本果汁聯(lián)合會(huì)研發(fā)和出版了同一檢測(cè)TAB方法 [4]。為了容易進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)，我們研發(fā)了該試劑盒。該試劑盒不同于會(huì)產(chǎn)生異味的愈創(chuàng)木酚的A. acidoterrestri試劑盒。Guaiacol Detection Kit Reference                                                                                        Guaiacol Detection Kit                                                                                                         

                                                                                                                                                                                       

           

 

◆試劑盒組成

YSG 瓊脂板20 塊板(貨號(hào)KYO-06810)

TAB純化的YSG瓊脂培養(yǎng)基

10×2 板/1 盒

 

Va-YSG 培養(yǎng)基 (2mL) 100 個(gè)管子(貨號(hào)KYO-08901)

加入到Y(jié)SG培養(yǎng)基的Vanillic acid ，用于愈創(chuàng)木酚的形成

2 mL×100 管

 

愈創(chuàng)木酚檢測(cè)試劑盒 100 次 (貨號(hào)KYO-08921)

試劑 1: 50mM 苯二甲酸氫鉀緩沖液	60 mL×2 瓶
試劑 2: 1.3 % 過(guò)氧化氫溶液	2.5 mL×1 管
試劑 3:過(guò)氧化物酶-磷酸緩沖液	2.5 mL×1 管
陽(yáng)性對(duì)照: Guaiacol  (1050 ppm)	2.5 mL×1 管

 

◆TAB測(cè)試流程圖-日本果汁協(xié)會(huì)

  

◆實(shí)驗(yàn)流程

1. 用接種環(huán)，10uL，在YSG瓊脂板上提取的新克隆，該克隆還沒(méi)有形成孢子。在“Va-YSG medium (2mL), ” (≥1×10⁸cfu/mL)管內(nèi)重懸該克隆。.

2. 孵育 45±1°C，3小時(shí)。

3. 加入1 mL“Guaiacol Detection Kit”的試劑1。

4. 加入20 μL“Guaiacol Detection Kit”的試劑 2 。

5. 加入20 μL 試劑3 of “Guaiacol Detection Kit”試劑3.

6. 混勻。

7. 放置5-10 分鐘。

8. 檢測(cè)培養(yǎng)基顏色的變化。*請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)觀察顏色變化。

Brown color indicates contamination of AAT

空白 (陰性對(duì)照) 

使用沒(méi)有接種的"Va-YSG medium (2mL)" ，進(jìn)行步驟(2)-(8).

陽(yáng)性對(duì)照

2 mL滅菌水和100 μL陽(yáng)性對(duì)照混合，進(jìn)行步驟 (3)-(8).

處理信息

? 請(qǐng)使用高壓滅菌方式處理已經(jīng)使用的培養(yǎng)基（121℃，超過(guò)30分鐘)

? 保存條件: 2-10 ℃，避光。

? 保質(zhì)期：制造后12個(gè)月

一般我們提供的產(chǎn)品保質(zhì)期在3個(gè)月到10個(gè)月。

欲了解詳情資料請(qǐng)點(diǎn)擊：果汁中嗜熱嗜酸菌的檢測(cè)方法——膜過(guò)濾法和涂布法

Guaiacol Detection Kit Flyer
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Q1：  我對(duì)TAB列舉法有些問(wèn)題。

          a. YSG滅菌水是什么意思，我想知道制備的比率。

          b.陽(yáng)性/陰性測(cè)試：樣品制備步驟提到的用YSG培養(yǎng)基稀釋，稀釋比例是多少？
          c.如果是水樣品的話，是不是用相同方法？

A1：   (a,b)回答: 
           "YSG distilled water"是錯(cuò)誤說(shuō)法，正確的說(shuō)法是“滅菌水”。制備比例的話，請(qǐng)參考下面的

           信息，不過(guò)具體案例具體分析。(參考數(shù)據(jù)來(lái)自日本果汁聯(lián)合會(huì)R).
           ——————————————————–
           果汁　　　　　　〔Brix 值〕　 　參考比例　　
           ———————————————————
           蘋果　　　　　　　 　〔70〕　???????? 10 倍
           橙子　　　　　　　〔65〕　???????? 10 倍
           紅葡萄　　　　　〔65〕　???????? 20-50 倍
           白葡萄　　　 〔65〕　???????? 20 倍
           胡蘿卜 　　　　　　 　〔40〕　?????????10 倍
           檸檬　　　　 　〔50〕　?????????10 倍　　　
           葡萄柚　　 　〔55〕　?????????20 倍
           桃子　　　　　　　 〔55〕　?????????10 倍
           ———————————————————
            c. 水樣品的話，是不是用相同方法？
            回答(c):對(duì)不起，我們不能明確告知是否可以運(yùn)用，我們手頭沒(méi)有相關(guān)記錄。
           有一種軟飲料“near water"，來(lái)自調(diào)味品，不是果汁（或者少量）和水。我們聽(tīng)說(shuō)該款產(chǎn)品可用

           于檢測(cè)該類飲料。 

Q2：   果糖能夠作為樣品嗎？

A2：   非常抱歉，我們這邊沒(méi)有關(guān)于愈創(chuàng)木酚檢測(cè)糖果（果糖）樣品的相關(guān)知識(shí)。所以我們建議參考簡(jiǎn)單

           流程，該流程修改自 “Japanese spore counting method of sugar samples”。如果你們有預(yù)處

           理微生物測(cè)試的流程，請(qǐng)按照你們的操作流程操作代替操作操作流程中的“樣品制備“。該流程中

           有制備YSG液體培養(yǎng)基的方法。如果 您使用我們提供的流程，不需要使用接種環(huán)和YSG瓊脂板。

Q3：   我們使用該試劑盒鑒定Alicyclobacillus acidoterrestris。我們的客戶是做墨西哥沙拉的，它們也

           有類似愈創(chuàng)木酚的異味。我們是否可以用該試劑盒去檢測(cè)沙拉中的愈創(chuàng)木酚(主要西紅柿，紅色)？紅

           色是否會(huì)干擾？

A3：   我們這邊沒(méi)有數(shù)據(jù)是關(guān)于愈創(chuàng)木酚檢測(cè)試劑盒檢測(cè)沙拉醬的案例。如果您考慮觀察方法，請(qǐng)參考下

           面的"注意事項(xiàng)" 。

           注意事項(xiàng)（1）：來(lái)自樣品的固體如果樣品的固體中有AAT，必須采取胃部處理或者勻漿去除固體的致

           病菌。

           注意事項(xiàng)（2）：材料中多酚的影響多酚是AAT（Alicyclobacillus acidoterrestris）生長(zhǎng)抑制劑。因此，

           檢測(cè)AAT必須稀釋樣品20~50倍。否則，無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。我們不清楚沙拉中有多少多酚。但是西紅

           柿是含有多酚的。一般稀釋10倍?？梢钥紤]沙拉稀釋超過(guò)20倍。

           注意事項(xiàng)（3）：關(guān)于樣品 的粘度。稀釋降低粘度。因子樣品必須適當(dāng)稀釋。請(qǐng)參考微生物稀釋比例檢測(cè)

           樣品，不包括抗熱嗜酸性細(xì)菌。注意事項(xiàng)(4):關(guān)于樣品到標(biāo)本上攜帶的顏色如果最終采用過(guò)氧化物酶

           方法，如果樣品帶有棕色的話，可能判斷起來(lái)很麻煩。如果樣品稀釋的話，我認(rèn)為不會(huì)引起大問(wèn)題。

           注意事項(xiàng)（4）：其他干擾材料如果使用過(guò)氧化物酶方法，通過(guò)過(guò)氧化物酶反應(yīng)會(huì)使愈創(chuàng)木酚 (AAT產(chǎn)物，

           會(huì)引起異味)聚合并且變成棕色。我們認(rèn)為沙拉醬包括不同的香味料可以作為材料。因此，如果有材料

           抑制過(guò)氧化物酶反應(yīng)或者含有的物質(zhì)可以起過(guò)氧化酶作用，通過(guò)過(guò)氧化物酶反應(yīng)變成棕色，會(huì)引起假

           陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果。

Q4：  如何接種TAB到Y(jié)SG瓊脂板上面？請(qǐng)?zhí)峁┝鞒獭?/span>

A4：    根據(jù)Japan Fruit Juice Association，有3種方法

            1) 傾注平皿的方法

            2) 用曲面玻璃棒涂布平板的方法 
            3) MF 方法
            如果告知客戶的樣品和檢測(cè)方法，我們可以推薦方法。

            對(duì)于您的信息，請(qǐng)讓我們知道在我們手冊(cè)里面TAB檢測(cè)的流程。

Q5：    是否提供不含香草酸的YSG培養(yǎng)基？

A5：    是的，我們提供不含香草酸的YSG培養(yǎng)基。然而售價(jià)會(huì)高，也需要額外時(shí)間考慮生產(chǎn)。另外，小批量生產(chǎn)

            會(huì)比較難。

Q6：    是否有數(shù)據(jù)或者參考文獻(xiàn)顯示 Guaiacol detection kit的準(zhǔn)確性? 我們的客戶希望提供上述信息。

A6：    關(guān)于產(chǎn)品的準(zhǔn)確性，Japan Institute of fruit juice認(rèn)可檢測(cè)操作手冊(cè)還有手冊(cè)上提到的批次準(zhǔn)確性的數(shù)據(jù)。

            然后，英文版的操作搜出不提供準(zhǔn)確性的信息。

            關(guān)于您的要求，請(qǐng)參考下面有研發(fā)者by developer(Motohiro Niwa)寫的論文 "Development of a rapid 

            detection method of A. acidoterrestiris, Hazardous bacteria to acidic beverage"

Q7：   我們需要下面兩者之一的微生物菌株A.acidobacillus 或者 A.acidoterrestris 去完成分析，制定質(zhì)量政

            策。是否可以從你們那邊獲得？

A7：   非常抱歉我們不能提供細(xì)菌菌株。您可以通過(guò)ATCC和DSMZ的當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商聯(lián)系購(gòu)買。

           http://www.atcc.org/About/tabid/138/Default.aspx
           http://www.dsmz.de/
           下面的菌株是分泌愈創(chuàng)木酚的。
           ———————————————————-
          ?　A.acidoterrestris　ATCC49025
          ?　A.acidoterrestris　DSM2498
          ?　A.acidoterrestris　DSM3923
          ?　A.acidoterrestris　DSM3924

Q8：    該試劑盒是否可用于牛奶或者啤酒？

A8：     關(guān)于牛奶和啤酒，我們沒(méi)有相關(guān)的信息。

Q9：    該試劑盒可以檢測(cè)多少愈創(chuàng)木酚？

A9：     Va-YSG 培養(yǎng)基 和Guaiacol detection kit能夠檢測(cè)25ppm愈創(chuàng)木酚。

Q10：  是否與關(guān)于假陽(yáng)性結(jié)果的信息？

A10：   如果樣品中有過(guò)氧化物酶或則過(guò)氧化氫酶的話，我們?cè)噭┖锌赡苓€有假陽(yáng)性的結(jié)果。

Q11：  是否可用BAT培養(yǎng)基代替YSG瓊脂？

A11：   他們的YSG瓊脂用這個(gè)試劑盒是可以的。我們推薦使用Va-YSG (KYO- 08901)用于下一步實(shí)驗(yàn)室（在YSG瓊

             脂上孵育后）。我們的試劑盒是基于 Japan Fruit Juice Association的操作流程， 不推薦使用BAT培養(yǎng)

              基。所以不能保證使用BAT培養(yǎng)基的結(jié)果。

Q12：  是否可用來(lái)檢測(cè)糖果？

A12：   對(duì)不起我們這邊沒(méi)有這方面信?？梢詤⒖?“Japanese spore counting method of sugar samples”。

             如果您與細(xì)菌檢測(cè)的預(yù)處理流程，請(qǐng)使用您的實(shí)驗(yàn)流程代替樣品處理。該流程中，有YSG液體培養(yǎng)基

             的制備方法。如果 您使用我們建議的流程，需要接種環(huán)和YSG瓊脂板。如果不適合您的樣品，建議修改。

Q13:    該試劑盒是否可以檢測(cè)Ethylvanillin 到Ethoxyphenol轉(zhuǎn)變?Ethoxyphenol也會(huì)類似愈創(chuàng)木酚，會(huì)有

            異味？

A13：  該試劑盒有比色法的結(jié)果，通過(guò)過(guò)氧化物酶反應(yīng)愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)變成四-愈創(chuàng)木酚檢測(cè)愈創(chuàng)木酚。關(guān)于2-

            Ethoxyphenol, 也會(huì)發(fā)生過(guò)氧化物酶反應(yīng)，會(huì)有比色法結(jié)果。然而我們之前沒(méi)有測(cè)試過(guò)，也沒(méi)有看

           到相關(guān)的文獻(xiàn)，不能確定。在很多化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中我們也沒(méi)有找到關(guān)于異味是由Ethoxyphenol引

           起的信息。

Q14：  該試劑盒可檢測(cè)蜂蜜嗎？

A14:     對(duì)不起，我們沒(méi)有做過(guò)類似實(shí)驗(yàn)。

Guaiakol_detection_kit_reference.pdf

【1】   G.Deinhard, et al., Bacillus acidoterrestris sp. nov., a new thermotolerant acidophile isolated from

            different soils. Syst. Appl. Microbiol. 10, 47-53 (1987)

【2】  GOTO, M., Spore-forming thermo-acidophilic bacilli of the genus Alicyclobacillus, Bokin Bobai, 28

           (8), 499-508 (2000), in Japanese

【3】  GOTO, K., Lecture on "Classification and identification of microbes" 1. Classification and properties

           of new thermo-acidophilic bacilli, January 2001 issue of Soft Drink Technical Data, 9-26 (2001), in 

           Japanese

【4】  Niwa, M., et al., Development of a rapid detection method of A.acidoterrestris, hazardous bacteria

           to acidic beverage. Fruit processing, 13, 102-107 (2003)

【5】  Japan Fruit Juice Association, On the unified test method for thermo-acidophilic bacilli, Report of 

           Japan Fruit Juice Association, 535, 4-12 (2003), in Japanese

【6】  Niwa, M., et al., A.acidoterretris rapid detection kit, Fruit processing, 13, 328-331 (2003)

【7】  Niwa, M., Control of deleterious bacteria in acidic beverages by using a guaiacol detection kit

           (peroxidase method), Japan Food Science, 2004-2, 23-28 (2004), in Japanese

【8】  Japan Laid-Open P2003-259A “Detection of guaiacol forming bacteria and/or its identification 

           method”