ScreenFect A+

DNA & siRNA轉(zhuǎn)染試劑！

◆原理

　　ScreenFect ™A+是通過點擊化學(xué)（Click Chemistry）方法篩選出的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。適用于各種真核細胞，也可直接添加到含有抗生素或者血清的培養(yǎng)基中。使用ScreenFect ™A+轉(zhuǎn)染試劑可將DNA和siRNA轉(zhuǎn)入常見實驗室培養(yǎng)的細胞株（HeLa、HepG2、MDCK等）、干細胞（小鼠ES細胞等），血液細胞（巨噬細胞、THP-1、RAW264等），小膠質(zhì)細胞和原代細胞。由于低細胞毒性，不含有任何有毒有害成分，轉(zhuǎn)染后無需更換培養(yǎng)基。

※1 Biomaterials. 2012 Nov; 33(32):8160-6. 2012

◆優(yōu)點、特色

●　DNA用量少。

●　高效一步轉(zhuǎn)染法。

●　轉(zhuǎn)染效率高＆細胞毒性低。

●　使用成本低

◆案例、應(yīng)用

【ScreenFect ™ A+ 轉(zhuǎn)染性能（流式細胞儀檢測）】

用于不同細胞的高效脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑!!

用于不同細胞的高效脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法!!

適用于難轉(zhuǎn)染的懸浮細胞!!

一步法和兩步法實驗流程的比較

產(chǎn)品名稱	ScreenFect ™ A plus	A廠家新產(chǎn)品 （+試劑）	A廠家產(chǎn)品
推薦的實驗流程	一步法	兩步法
實驗用時	2天	3天
所需DNA量	低	高
細胞數(shù)目調(diào)整	靈活 （細胞準備僅在轉(zhuǎn)染之前）	不靈活 （取決于細胞預(yù)培養(yǎng)條件）
胰酶消化	需要 （僅在轉(zhuǎn)染之前）	需要 （在細胞預(yù)培養(yǎng)之前）
適于高通量篩選	+++++	+
培養(yǎng)基的更換	取決于細胞系

一步法比兩步法節(jié)省24小時！

      ScreenA+.pdf

高性價比的高性能基因?qū)朐噭?/span>

ScreenFect ™ 通信

基因?qū)肴薸PS細胞實驗數(shù)據(jù)

　　介紹使用ScreenFect ™A plus將基因?qū)肴薸PS細胞的實驗結(jié)果和操作步驟。本文記載了作為iPS細胞支架使用的Matrigel孔板包被方法、配制含有Y-27632的細胞懸浮液的操作步驟以及最優(yōu)的試劑比例，供您參考。

 

◆導(dǎo)入人iPS細胞（201B7株）的轉(zhuǎn)染操作實例

　　在這里，我們將介紹一些使用StemSure^? hPSC培養(yǎng)基Δ（產(chǎn)品編號：197-17571）的操作實例。該操作步驟的完整版和使用mTeSR1培養(yǎng)基的操作步驟，請查看Woko公司的官網(wǎng)。http://db.screenfect.jp/ja/documents/list/protocol

 

<轉(zhuǎn)染試劑的配制>

將2.0μL 的ScreenFect ™ A plus reagent、4.0μg的質(zhì)粒DNA加入到160μL的Opti-MEM中制成DNA-lipid complex。

 

< Matrigel包被孔板>

1.  4°C下溶解Matrigel hESC-Qualified Matrix。為防止發(fā)生凝固，請避免在室溫下溶解。

2.  用25 mL冷卻的D-MEM/Ham's F-12稀釋300μL的Matrigel。

3.  稀釋后的Matrigel溶液按照1mL/well加入到12孔板中。

4.  在室溫下孵育1小時以上。

 

<細胞懸液的配制>

1.  將StemSure^? hPSC培養(yǎng)基Δ在2-8℃下放置數(shù)小時或過夜緩慢融解。不要在37°C下解凍，并在一周內(nèi)使用。

2.  將bFGF（產(chǎn)品編號：064-05381,068-05384）按照終濃度35-100ng/mL添加到融解后的StemSure^? hPSC培養(yǎng)基△中，配制成完全培養(yǎng)基（以下稱為sshPSC培養(yǎng)基）。

3.  使用前將sshPSC培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫。不要使用溫水浴。

4.  將Y-27632按照終濃度10μmol/L添加到sshPSC培養(yǎng)基中（以下稱為ROCKi+培養(yǎng)基）。

5.  去除hiPS細胞培養(yǎng)孔板中的培養(yǎng)基，用PBS（-）清洗細胞一次。

*請在細胞匯片達到80％且處于對數(shù)增殖期時進行細胞轉(zhuǎn)染。

6.  除去PBS（-），添加Stempro Accutase。

7.  在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中靜置5分鐘

8.  用1mL微量移液槍添加ROCKi+培養(yǎng)基，將細胞從培養(yǎng)板上分離并吹散成單細胞。

9.  轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。

10. 室溫下1000rpm（約170×g）離心3分鐘。

11. 去除上清，用ROCKi+培養(yǎng)基重懸細胞。

12. 計算活細胞的數(shù)量。

13. 用ROCKi+培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至5×10⁵cells/mL。

 

<轉(zhuǎn)染>

添加1mL配制好的DNA-lipid complex到細胞懸液中，使用移液器充分混勻，并接種在12孔板中。

※要點

接種24小時后請更換培養(yǎng)基。此時的培養(yǎng)基不需要含有Y-27632。

 

◆實驗數(shù)據(jù)

　　通過反向轉(zhuǎn)染（1-STEP）將GFP融合基因?qū)雋iPS細胞（201B7株），并通過熒光顯微鏡比較基因的導(dǎo)入效率。

 

<StemSure^? hPSC培養(yǎng)基Δ的使用>

細胞數(shù)：5×10⁵ cells/well

質(zhì)粒DNA量：4μg/assay

轉(zhuǎn)染試劑混合比例：DNA量（μg）：ScreenFect ™ A plus reagent (μL)=1 : 0.5

容器：12孔板

備注：用Opti-MEM稀釋ScreenFect ™ A plus reagent和DNA。

 

<mTeSR1 培養(yǎng)基的使用>

細胞數(shù)：5 x 10⁵cells/well

質(zhì)粒DNA量：1μg/assay

轉(zhuǎn)染試劑混合比例：DNA數(shù)量（μg）：ScreenFect ™ A plus reagent (μL)=1 : 2

容器：12孔板

備注：用Opti-MEM稀釋ScreenFect ™ A plus reagent和DNA。

 

◆使用上的注意

●　建議在單細胞狀態(tài)下進行人iPS細胞的基因?qū)搿?/span>

●　建議基因?qū)霑r的細胞數(shù)約為5×10⁵cells/well。

●　當(dāng)質(zhì)粒DNA量多時，導(dǎo)入基因的表達量高會引起細胞死亡。

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	包裝
293-77101	ScreenFect ™ A plus	基因研究用	0.2mL
299-77103			1mL
297-77104			1mL×5

[1]	Diefenbacher, Markus E., et al. "The LIM Domain Protein nTRIP6 Recruits the Mediator Complex to AP-1-Regulated Promoters." PLoS ONE 9.5 (2014): e97549.
[2]	Freise, Christian, and Uwe Querfeld. "Inhibition of vascular calcification by block of intermediate conductance calcium-activated potassium channels with TRAM-34." Pharmacological Research (2014).
[3]	Hagiwara, Akane, et al. "Luteinizing Hormone-Induced Expression of Ptger4b, a Prostaglandin E2 Receptor Indispensable for Ovulation of the Medaka Oryzias latipes, Is Regulated by a Genomic Mechanism Involving Nuclear Progestin Receptor."
[4]	Peng, Yanyan, Ruidan Xu, and Xiaofeng Zheng. "HSCARG Negatively Regulates the Cellular Antiviral RIG-I Like Receptor Signaling Pathway by Inhibiting TRAF3 Ubiquitination via Recruiting OTUB1." PLoS pathogens 10.4 (2014): e1004041. (3)
[5]	Wakimoto, Hiroaki, et al. "Targetable signaling pathway mutations are associated with malignant phenotype in IDH-mutant gliomas." Clinical Cancer Research (2014). (2)
[6]	Fischer, Simon, et al. "Breaking limitations of complex culture media: Functional non-viral miRNA delivery into pharmaceutical production cell lines." Journal of biotechnology 168.4 (2013): 589-600.
[7]	Bai, Dongmei, et al. "Regulation of the HDM2-p53 pathway by ribosomal protein L6 in response to ribosomal stress." Nucleic acids research 42.3 (2014): 1799-1811.
[8]	Liu, Xing, et al. "Isocitrate dehydrogenase 2 mutation is a frequent event in osteosarcoma detected by a multi‐specific monoclonal antibody MsMab‐1." Cancer medicine 2.6 (2013): 803-814.