無DMSO干細(xì)胞凍存液

StemCell Keep

StemCell Keep 是一種高效的玻璃化細(xì)胞凍存液，用于靈長類胚胎干細(xì)胞（ES）和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPS）的保存。

◆特點(diǎn)?優(yōu)勢

    ●    無動物源蛋白、無DMSO；

    ●    通過玻璃化保護(hù)ES和iPS細(xì)胞；

    ●    可維持干細(xì)胞分化能力；

    ●    采用新型冷凍保護(hù)劑，可利用玻璃化冷凍技術(shù)進(jìn)行ES和iPS細(xì)胞克隆的高效保

           存；

    ●    足夠分裝100管；

    ●    無細(xì)菌、真菌和支原體污染；

    ●    保質(zhì)期長，4℃下可保存2年

　    * 僅用于科學(xué)研究，不能用于臨床診斷。

◆案例?應(yīng)用

冷凍玻璃化

靈長類ES和iPS細(xì)胞對冷凍損害非常敏感

●   靈長類ES和iPS細(xì)胞用含10% DMSO的凍存液-80℃保存后活性很低

●   靈長類ES和iPS細(xì)胞克隆在上述條件下活力很低

                      ↓

通過玻璃化低溫保存ES和iPS細(xì)胞

●   玻璃化是使液體形成玻璃狀物質(zhì)

●   使用玻璃化溶液懸浮細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐防止水分缺失

●   細(xì)胞在冷凍過程中被保護(hù)

                      ↓

玻璃化技術(shù)保存ES和iPS細(xì)胞存在的問題

●  由于玻璃化的形成需要高濃度的溶液，高滲透壓對細(xì)胞有毒性

●  操作時(shí)需要快速溶解細(xì)胞，以防重結(jié)晶

●  操作需要經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員

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常規(guī)玻璃化溶液存在的問題

●  大體積(200 μL) 的玻璃化溶液可造成玻璃化條件的不穩(wěn)定性

●  傳統(tǒng)的玻璃化溶液含有DMSO和乙酰胺，DMSO對OCT-4的表達(dá)有影響，而乙酰胺被認(rèn)為是一種致癌物

                      ↓

StemCell Keep是一種新穎的玻璃化溶液，

可改善傳統(tǒng)玻璃化溶液存在的問題。

　對比數(shù)據(jù)

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反映了人iPS細(xì)胞凍存之后的克隆形成率和復(fù)蘇率。接種后第一天，以未冷凍保存細(xì)胞100%的克隆形成率為對照，DAP213（常用作玻璃化試劑）凍存細(xì)胞只有15%的克隆形成率，而StemCell凍存細(xì)胞的克隆形成率為80%。接種后第四天，細(xì)胞生長為大克隆之后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的復(fù)蘇率，StemCell凍存iPS 細(xì)胞的復(fù)蘇率達(dá)到62%，明顯優(yōu)于DAP213凍存細(xì)胞28%的復(fù)蘇率。

實(shí)驗(yàn)操作步驟　

※ 在具體實(shí)驗(yàn)展開之前請先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

凍存步驟

1. 在超凈臺上放置一個(gè)裝滿液氮的保溫瓶；

2. 用含0.25%的胰蛋白酶和1mg/mL IV型膠原酶的PBS溶液解離ES/iPS細(xì)胞；

* 一個(gè)60mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，約可分裝1-5管；

3. 離心，去上清( 需在冰上操作)；

4. 用200μL的StemCell懸浮細(xì)胞。將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中放置1分鐘；

* 如果玻璃化成功，溶液應(yīng)呈透明狀。

5. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。

 

復(fù)蘇步驟

1. 準(zhǔn)備含有9mL細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管，37℃水??；

   * 一次復(fù)蘇一管。

2. 將凍存管從液氮罐轉(zhuǎn)移至含有液氮的保溫瓶中，在超凈臺上操作；

3. 迅速添加1mL預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基，用槍頭輕輕混勻 ；

4. 將所有的稀釋后細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心洗脫細(xì)胞；

5. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

人iPS細(xì)胞StemCell凍存復(fù)蘇之后的分化能力

　　細(xì)胞的未分化標(biāo)記物ALP(A)、OCT-4 (B)、SSEA-4 (C) 和TRA-1-60(D) 染色都為陽性，保持著未分化狀態(tài)。

人iPS細(xì)胞StemCell凍存復(fù)蘇之后的分化能力 　人iPS細(xì)胞形成擬胚體之后，在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周，依然可以檢測到未分化標(biāo)記。